Un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tPA
Summary
Los modelos tradicionales de ictus fototrombótico (SPT) inducen principalmente agregados plaquetarios densos de alta resistencia al tratamiento lítico con activadores tisulares del plasminógeno (tPA). Aquí se introduce un modelo de PTS murino modificado mediante la coinyección de trombina y colorante fotosensible para la fotoactivación. El modelo de SPT potenciado con trombina produce coágulos mixtos de plaquetas:fibrina y es muy sensible a la trombólisis tPA.
Abstract
Un modelo ideal de accidente cerebrovascular tromboembólico requiere ciertas propiedades, incluidos procedimientos quirúrgicos relativamente simples con baja mortalidad, un tamaño y ubicación del infarto consistentes, precipitación de coágulos sanguíneos entremezclados plaquetas:fibrina similares a los de los pacientes y una sensibilidad adecuada al tratamiento fibrinolítico. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico basado en colorante de rosa de bengala (RB) cumple con los dos primeros requisitos, pero es altamente refractario al tratamiento lítico mediado por tPA, presumiblemente debido a su composición de coágulos rica en plaquetas, pero pobre en fibrina. Razonamos que la combinación de colorante RB (50 mg/kg) y una dosis subtrombótica de trombina (80 U/kg) para la fotoactivación dirigida a la rama proximal de la arteria cerebral media (ACM) puede producir coágulos enriquecidos en fibrina y sensibles al tPA. De hecho, el modelo de fototrombosis combinada de trombina y RB (T+RB) desencadenó coágulos sanguíneos mixtos de plaquetas:fibrina, como lo demuestran las inmunotinciones y las inmunomanchas, y mantuvo tamaños y ubicaciones de infarto consistentes, además de una baja mortalidad. Además, la inyección intravenosa de tPA (alteplasa, 10 mg/kg) dentro de las 2 h posteriores a la fotoactivación disminuyó significativamente el tamaño del infarto en la fototrombosis T+RB. Por lo tanto, el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina puede ser un modelo experimental útil para probar nuevas terapias trombolíticas.
Introduction
La trombectomía endovascular y la trombólisis mediada por tPA son las únicas dos terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el accidente cerebrovascular isquémico agudo, que afecta a ~ 700,000 pacientes anualmente enlos Estados Unidos. Debido a que la aplicación de la trombectomía se limita a la oclusión de vasos grandes (LVO), mientras que la trombólisis tPA puede aliviar las oclusiones de vasos pequeños, ambas son terapias valiosas para el accidente cerebrovascular isquémico agudo2. Además, la combinación de ambas terapias (p. ej., inicio de la tPA-trombólisis dentro de las 4,5 horas posteriores al inicio del ictus, seguida de trombectomía) mejora la reperfusión y los resultados funcionales3. Por lo tanto, la optimización de la trombólisis sigue siendo un objetivo importante para la investigación del ictus, incluso en la era de la trombectomía.
Los modelos tromboembólicos son una herramienta esencial para la investigación preclínica del ictus con el objetivo de mejorar las terapias trombolíticas. Esto se debe a que los modelos de oclusión vascular mecánica (p. ej., oclusión de ACM con sutura intraluminal) no producen coágulos sanguíneos, y su rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la eliminación de la oclusión mecánica está excesivamente idealizada 4,5. Hasta la fecha, los principales modelos tromboembólicos incluyen fototrombosis 6,7,8, aplicación tópica de cloruro férrico (FeCl3)9, microinyección de trombina en la rama MCA 10,11, inyección de (micro)émbolos ex vivo en la ACM o arteria carótida común (CCA)12,13,14 e hipoxia-isquemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Estos modelos de accidente cerebrovascular difieren en la composición histológica de los coágulos subsiguientes y en la sensibilidad a las terapias líticas mediadas por tPA (Tabla 1). También varían en el requerimiento quirúrgico de la craneotomía (necesaria para la inyección de trombina in situ y la aplicación tópica de FeCl3), la consistencia del tamaño y la ubicación del infarto (p. ej., la infusión de microémbolos con CCA produce resultados muy variables) y los efectos globales sobre el sistema cardiovascular (p. ej., la tHI aumenta la frecuencia cardíaca y el gasto cardíaco para compensar la vasodilatación periférica inducida por hipoxia).
El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico (PTS) basado en colorante RB tiene muchas características atractivas, incluidos procedimientos quirúrgicos simples sin craneotomía, baja mortalidad (generalmente < 5%) y un tamaño y ubicación predecibles del infarto (en el territorio proveedor de MCA), pero tiene dos limitaciones principales. 8 La primera advertencia es la respuesta débil o nula al tratamiento trombolítico mediado por tPA, que también es un inconveniente del modelo FeCl3 7,19,20. La segunda advertencia de los modelos de accidente cerebrovascular PTS y FeCl3 es que los trombos resultantes consisten en agregados plaquetarios densamente empaquetados con una pequeña cantidad de fibrina, lo que no solo conduce a su resistencia a la terapia tPA-lítica, sino que también se desvía del patrón de trombos de plaquetas:fibrina entremezclados en pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo21,22. Por el contrario, el modelo de microinyección de trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizada y un contenido incierto de plaquetas10.
Teniendo en cuenta el razonamiento anterior, planteamos la hipótesis de que la mezcla de RB y una dosis subtrombótica de trombina para la fotoactivación dirigida a MCA a través del cráneo adelgazado puede aumentar el componente de fibrina en los trombos resultantes y aumentar la sensibilidad al tratamiento lítico mediado por tPA. Hemos confirmado esta hipótesis23 y en este trabajo describimos en detalle los procedimientos del modelo de ictus fototrombótico modificado (T+RB).
Protocol
Representative Results
Discussion
El accidente cerebrovascular fototrombótico RB tradicional, introducido en 1985, es un modelo atractivo de isquemia cerebral focal para procedimientos quirúrgicos simples, baja mortalidad y alta reproducibilidad del infarto cerebral. 5 En este modelo, el colorante fotodinámico RB activa rápidamente las plaquetas al excitarse con la luz, lo que da lugar a agregados densos que ocluyen el vaso sanguíneo 5,8,23.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH (NS108763, NS100419, NS095064 y HD080429 a C.Y.K.; y NS106592 a Y.Y.S.).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
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