نموذج السكتة الدماغية الضوئية الخثارية المخصبة بالفيبرين والحساسة ل tPA
Summary
تحفز نماذج السكتة الدماغية الضوئية التقليدية (PTS) بشكل أساسي مجاميع الصفائح الدموية الكثيفة ذات المقاومة العالية لمنشط البلازمينوجين النسيجي (tPA) – العلاج المحلل. هنا يتم تقديم نموذج PTS الفئران المعدل عن طريق الحقن المشترك للثرومبين والصبغة الحساسة للضوء للتنشيط الضوئي. ينتج نموذج PTS المعزز بالثرومبين صفائح صفيحة مختلطة: جلطات الفيبرين وهو حساس للغاية لانحلال الخثرة tPA.
Abstract
يتطلب نموذج السكتة الدماغية الانصمام الخثاري المثالي خصائص معينة ، بما في ذلك الإجراءات الجراحية البسيطة نسبيا مع انخفاض معدل الوفيات ، وحجم وموقع احتشاء ثابت ، وترسيب الصفائح الدموية: جلطات دموية مختلطة بالفيبرين مماثلة لتلك الموجودة في المرضى ، وحساسية كافية للعلاج بتحلل الفيبرين. يلبي نموذج السكتة الدماغية الضوئية القائمة على صبغة البنغال الوردية (RB) الشرطين الأولين ولكنه شديد المقاومة للحرارة للعلاج المحللي بوساطة tPA ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تركيبة الجلطة الغنية بالصفائح الدموية ، ولكن الفقيرة بالفيبرين. نحن السبب في أن الجمع بين صبغة RB (50 مجم / كجم) وجرعة فرعية من الثرومبين (80 وحدة / كجم) للتنشيط الضوئي الذي يستهدف الفرع القريب من الشريان الدماغي الأوسط (MCA) قد ينتج جلطات غنية بالفيبرين وحساسة ل tPA. في الواقع ، أدى نموذج الجلطة الضوئية المشترك للثرومبين و RB (T + RB) إلى ظهور صفائح دموية مختلطة: جلطات دم الفيبرين ، كما هو موضح في التلوين المناعي والبقع المناعية ، وحافظت على أحجام ومواقع احتشاء متسقة بالإضافة إلى انخفاض معدل الوفيات. علاوة على ذلك ، فإن الحقن الوريدي ل tPA (Alteplase ، 10 مجم / كجم) في غضون 2 ساعة بعد التنشيط الضوئي قلل بشكل كبير من حجم الاحتشاء في تجلط الدم الضوئي T + RB. وبالتالي ، قد يكون نموذج السكتة الدماغية التخثر الضوئي المعزز بالثرومبين نموذجا تجريبيا مفيدا لاختبار علاجات التخثر الجديدة.
Introduction
استئصال الخثرة داخل الأوعية الدموية وانحلال الخثرة بوساطة tPA هما العلاجان الوحيدان المعتمدان من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للسكتة الدماغية الحادة ، والتي تصيب ~ 700000 مريض سنويا في الولايات المتحدة1. نظرا لأن تطبيق استئصال الخثرة يقتصر على انسداد الأوعية الدموية الكبيرة (LVO) ، في حين أن انحلال الخثرة tPA قد يخفف من انسداد الأوعية الصغيرة ، فإن كلاهما علاجات قيمة للسكتة الدماغية الحادة2. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين كلا العلاجين (على سبيل المثال ، بدء انحلال الخثرة tPA في غضون 4.5 ساعة من بداية السكتة الدماغية ، تليها استئصال الخثرة) يحسن التروية والنتائج الوظيفية3. وبالتالي ، يظل تحسين انحلال الخثرة هدفا مهما لأبحاث السكتة الدماغية ، حتى في عصر استئصال الخثرة.
تعد نماذج الانصمام الخثاري أداة أساسية لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية التي تهدف إلى تحسين علاجات التخثر. وذلك لأن نماذج انسداد الأوعية الدموية الميكانيكية (على سبيل المثال ، انسداد MCA داخل اللمعة) لا تنتج جلطات دموية ، واستعادتها السريعة لتدفق الدم الدماغي بعد إزالة الانسداد الميكانيكي مثالية بشكل مفرط 4,5. حتى الآن ، تشمل نماذج الانصمام الخثاري الرئيسية تجلط الدمالضوئي 6،7،8 ، وتطبيق كلوريد الحديديك الموضعي (FeCl3)9 ، والحقن المجهري للثرومبين في فرع MCA 10،11 ، وحقن الصمات خارج الجسم الحي (الدقيقة) في MCA أو الشريان السباتي المشترك (CCA) 12،13،14 ، ونقص الأكسجة العابر (tHI) 15,16 ، 17,18. تختلف نماذج السكتة الدماغية هذه في التركيب النسيجي للجلطات اللاحقة والحساسية للعلاجات المحللة بوساطة tPA (الجدول 1). كما أنها تختلف في المتطلبات الجراحية لحج القحف (اللازمة لحقن الثرومبين في الموقع والتطبيق الموضعي ل FeCl3) ، واتساق حجم الاحتشاء وموقعه (على سبيل المثال ، تسريب CCA من microemboli ينتج عنه نتائج متغيرة للغاية) ، والتأثيرات العالمية على نظام القلب والأوعية الدموية (على سبيل المثال ، يزيد tHI من معدل ضربات القلب والنتاج القلبي للتعويض عن توسع الأوعية المحيطية الناجم عن نقص الأكسجة).
يتميز نموذج السكتة الدماغية الضوئية القائمة على صبغة RB (PTS) بالعديد من الميزات الجذابة ، بما في ذلك الإجراءات الجراحية البسيطة الخالية من حج القحف ، وانخفاض معدل الوفيات (عادة < 5٪) ، وحجم وموقع احتشاء يمكن التنبؤ به (في المنطقة الموردة ل MCA) ، ولكن له قيدان رئيسيان. 8 التحذير الأول هو استجابة ضعيفة إلى معدومة للعلاج التخثري بوساطة tPA ، وهو أيضا عيب في نموذج FeCl 3 7،19،20. التحذير الثاني من نماذج السكتة الدماغية PTS و FeCl3 هو أن الجلطات الدموية التي تلت ذلك تتكون من مجاميع الصفائح الدموية المعبأة بكثافة مع كمية صغيرة من الفيبرين ، والتي لا تؤدي فقط إلى مرونتها للعلاج tPA-lytic ، ولكن أيضا تنحرف عن نمط الصفائح الدموية المختلطة:الجلطات الدموية الفيبرين في مرضى السكتة الدماغية الحادة21,22. في المقابل ، يشتمل نموذج حقن الثرومبين الدقيق في الموقع بشكل أساسي على الفيبرين المبلمر ومحتوى غير مؤكد من الصفائح الدموية10.
بالنظر إلى المنطق أعلاه ، افترضنا أن اختلاط RB وجرعة فرعية من الثرومبين للتنشيط الضوئي المستهدف MCA من خلال الجمجمة الرقيقة قد يزيد من مكون الفيبرين في الجلطات الناتجة ويعزز الحساسية للعلاج المحللي بوساطة tPA. لقد أكدنا هذه الفرضية ،23 وهنا نصف الإجراءات التفصيلية لنموذج السكتة الدماغية الخثارية الضوئية المعدل (T + RB).
Protocol
Representative Results
Discussion
السكتة الدماغية الضوئية RB التقليدية ، التي تم تقديمها في عام 1985 ، هي نموذج جذاب لنقص التروية الدماغية البؤري للإجراءات الجراحية البسيطة ، وانخفاض معدل الوفيات ، وارتفاع قابلية استنساخ احتشاء الدماغ. 5 في هذا النموذج ، تقوم الصبغة الديناميكية الضوئية RB بتنشيط الصفائح الدموية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NS108763 و NS100419 و NS095064 و HD080429 إلى C.Y. K. ؛ و NS106592 إلى YYS).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
