Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA
Summary
I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un’elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.
Abstract
Un modello ideale di ictus tromboembolico richiede determinate proprietà, tra cui procedure chirurgiche relativamente semplici con bassa mortalità, dimensioni e posizione dell’infarto coerenti, precipitazione di coaguli di sangue misto piastrino-fibrina simili a quelli dei pazienti e un’adeguata sensibilità al trattamento fibrinolitico. Il modello di ictus fototrombotico a base di colorante rosa bengala (RB) soddisfa i primi due requisiti, ma è altamente refrattario al trattamento litico mediato da tPA, presumibilmente a causa della sua composizione del coagulo ricca di piastrine, ma povera di fibrina. Ragioniamo che la combinazione di colorante RB (50 mg/kg) e una dose sub-trombotica di trombina (80 U/kg) per la fotoattivazione mirata al ramo prossimale dell’arteria cerebrale media (MCA) può produrre coaguli arricchiti di fibrina e sensibili al tPA. Infatti, il modello di fototrombosi combinato con trombina e RB (T+RB) ha innescato coaguli di sangue misti piastrina:fibrina, come dimostrato dall’immunocolorazione e dagli immunoblots, e ha mantenuto dimensioni e posizioni dell’infarto coerenti, oltre a una bassa mortalità. Inoltre, l’iniezione endovenosa di tPA (Alteplase, 10 mg/kg) entro 2 ore dalla fotoattivazione ha ridotto significativamente le dimensioni dell’infarto nella fototrombosi T+RB. Pertanto, il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina può essere un utile modello sperimentale per testare nuove terapie trombolitiche.
Introduction
La trombectomia endovascolare e la trombolisi mediata da tPA sono le uniche due terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l’ictus ischemico acuto, che affligge ~700.000 pazienti all’annonegli Stati Uniti. Poiché l’applicazione della trombectomia è limitata all’occlusione dei grandi vasi (LVO), mentre la trombolisi tPA può alleviare le occlusioni dei piccoli vasi, entrambe sono terapie preziose per l’ictus ischemico acuto2. Inoltre, la combinazione di entrambe le terapie (ad esempio, l’inizio della trombolisi tPA entro 4,5 ore dall’insorgenza dell’ictus, seguita da trombectomia) migliora la riperfusione e gli esiti funzionali3. Pertanto, l’ottimizzazione della trombolisi rimane un obiettivo importante per la ricerca sull’ictus, anche nell’era della trombectomia.
I modelli tromboembolici sono uno strumento essenziale per la ricerca preclinica sull’ictus che mira a migliorare le terapie trombolitiche. Ciò è dovuto al fatto che i modelli di occlusione vascolare meccanica (ad esempio, l’occlusione MCA della sutura intraluminale) non producono coaguli di sangue e il suo rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione dell’occlusione meccanica è eccessivamente idealizzato 4,5. Ad oggi, i principali modelli tromboembolici includono la fototrombosi 6,7,8, l’applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl3)9, la microiniezione di trombina nel ramo MCA 10,11, l’iniezione di (micro)emboli ex vivo nell’MCA o nell’arteria carotide comune (CCA)12,13,14 e l’ipossia-ischemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Questi modelli di ictus differiscono nella composizione istologica dei coaguli che ne derivano e nella sensibilità alle terapie litiche mediate da tPA (Tabella 1). Variano anche nella necessità chirurgica di craniotomia (necessaria per l’iniezione di trombina in situ e l’applicazione topica di FeCl3), nella consistenza delle dimensioni e della posizione dell’infarto (ad esempio, l’infusione di microemboli da parte di CCA produce risultati molto variabili) e negli effetti globali sul sistema cardiovascolare (ad esempio, il tHI aumenta la frequenza cardiaca e la gittata cardiaca per compensare la vasodilatazione periferica indotta dall’ipossia).
Il modello di ictus fototrombotico (PTS) basato su coloranti RB ha molte caratteristiche interessanti, tra cui semplici procedure chirurgiche senza craniotomia, bassa mortalità (in genere < 5%) e dimensioni e posizione prevedibili dell'infarto (nel territorio di fornitura di MCA), ma presenta due principali limitazioni. 8 Il primo avvertimento è la risposta debole a nulla al trattamento trombolitico mediato da tPA, che è anche uno svantaggio del modelloFeCl 3 7,19,20. Il secondo avvertimento dei modelli di ictus PTS e FeCl3 è che i trombi che ne derivano sono costituiti da aggregati piastrinici densamente impacchettati con una piccola quantità di fibrina, che non solo portano alla sua resilienza alla terapia tPA-litica, ma si discostano anche dal modello di trombi piastrinici:fibrina misti nei pazienti con ictus ischemico acuto21,22. Al contrario, il modello di microiniezione di trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizzata e un contenuto incerto di piastrine10.
Dato il ragionamento di cui sopra, abbiamo ipotizzato che la miscela di RB e una dose sub-trombotica di trombina per la fotoattivazione mirata a MCA attraverso il cranio assottigliato possa aumentare la componente di fibrina nei trombi risultanti e aumentare la sensibilità al trattamento litico mediato da tPA. Abbiamo confermato questa ipotesi,23 e qui descriviamo in dettaglio le procedure del modello di ictus fototrombotico modificato (T+RB).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ictus fototrombotico RB tradizionale, introdotto nel 1985, è un modello interessante di ischemia cerebrale focale per semplici procedure chirurgiche, bassa mortalità e alta riproducibilità dell’infarto cerebrale. 5 In questo modello, il colorante fotodinamico RB attiva rapidamente le piastrine all’eccitazione della luce, portando a densi aggregati che occludono il vaso sanguigno 5,8,23. Tuttavia, la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 a C.Y.K.; e NS106592 a Y.Y.S.).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
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