Een fibrine-verrijkt en tPA-gevoelig fototrombotisch beroertemodel
Summary
Traditionele modellen met fototrombotische beroerte (PTS) induceren voornamelijk dichte bloedplaatjesaggregaten met een hoge weerstand tegen weefselplasminogeenactivator (tPA)-lytische behandeling. Hier wordt een gemodificeerd muizen PTS-model geïntroduceerd door trombine en lichtgevoelige kleurstof samen te injecteren voor fotoactivering. Het trombine-versterkte PTS-model produceert gemengde bloedplaatjes:fibrinestolsels en is zeer gevoelig voor tPA-trombolyse.
Abstract
Een ideaal trombo-embolisch beroertemodel vereist bepaalde eigenschappen, waaronder relatief eenvoudige chirurgische ingrepen met een lage mortaliteit, een consistente infarctgrootte en -locatie, precipitatie van bloedplaatjes:fibrine vermengde bloedstolsels vergelijkbaar met die bij patiënten, en een adequate gevoeligheid voor fibrinolytische behandeling. Het op kleurstof gebaseerde fototrombotische beroertemodel van de bengaalse roos (RB) voldoet aan de eerste twee vereisten, maar is zeer ongevoelig voor tPA-gemedieerde lytische behandeling, vermoedelijk vanwege de bloedplaatjesrijke, maar fibrine-arme stolselsamenstelling. We redeneren dat een combinatie van RB-kleurstof (50 mg/kg) en een subtrombotische dosis trombine (80 E/kg) voor fotoactivatie gericht op de proximale tak van de middelste hersenslagader (MCA) fibrine-verrijkte en tPA-gevoelige stolsels kan produceren. Inderdaad, het trombine en RB (T+RB)-gecombineerde fototrombosemodel veroorzaakte gemengde bloedplaatjes:fibrine-bloedstolsels, zoals aangetoond door immunokleuring en immunoblots, en handhaafde consistente infarctgroottes en -locaties plus een lage mortaliteit. Bovendien verminderde intraveneuze injectie van tPA (Alteplase, 10 mg/kg) binnen 2 uur na fotoactivatie de infarctgrootte bij T+RB-fototrombose aanzienlijk. Het trombine-versterkte fototrombotische beroertemodel kan dus een nuttig experimenteel model zijn om nieuwe trombolytische therapieën te testen.
Introduction
Endovasculaire trombectomie en tPA-gemedieerde trombolyse zijn de enige twee door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde therapieën van acute ischemische beroerte, die jaarlijks ~700.000 patiënten in deVerenigde Staten treft. Omdat de toepassing van trombectomie beperkt is tot occlusie van grote bloedvaten (LVO), terwijl tPA-trombolyse occlusies van kleine bloedvaten kan verlichten, zijn beide waardevolle therapieën voor acute ischemische beroerte2. Bovendien verbetert de combinatie van beide therapieën (bijv. start van tPA-trombolyse binnen 4,5 uur na het begin van de beroerte, gevolgd door trombectomie) de reperfusie en defunctionele uitkomsten. Het optimaliseren van trombolyse blijft dus een belangrijk doel voor onderzoek naar beroertes, zelfs in het tijdperk van trombectomie.
Trombo-embolische modellen zijn een essentieel hulpmiddel voor preklinisch onderzoek naar beroertes dat gericht is op het verbeteren van trombolytische therapieën. Dit komt omdat mechanische vasculaire occlusiemodellen (bijv. intraluminale hechting MCA-occlusie) geen bloedstolsels produceren en het snelle herstel van de cerebrale bloedstroom na het verwijderen van mechanische occlusie overdreven geïdealiseerd is 4,5. Tot op heden omvatten de belangrijkste trombo-embolische modellen fototrombose 6,7,8, topisch ijzerchloride (FeCl3) toepassing9, micro-injectie van trombine in de MCA-tak 10,11, injectie van ex vivo (micro)embolie in de MCA of gemeenschappelijke halsslagader (CCA)12,13,14 en voorbijgaande hypoxie-ischemie (tHI)15,16, 17,18. Deze beroertemodellen verschillen in de histologische samenstelling van de resulterende stolsels en de gevoeligheid voor tPA-gemedieerde lytische therapieën (tabel 1). Ze variëren ook in de chirurgische vereiste van craniotomie (nodig voor in situ trombine-injectie en plaatselijke toepassing van FeCl3), de consistentie van de grootte en locatie van het infarct (bijv. CCA-infusie van micro-embolieën levert zeer variabele uitkomsten op) en globale effecten op het cardiovasculaire systeem (bijv. tHI verhoogt de hartslag en het hartminuutvolume om hypoxie-geïnduceerde perifere vasodilatatie te compenseren).
Het op RB-kleurstof gebaseerde fototrombotische beroerte (PTS)-model heeft veel aantrekkelijke kenmerken, waaronder eenvoudige craniotomievrije chirurgische ingrepen, lage mortaliteit (meestal < 5%) en een voorspelbare grootte en locatie van het infarct (in het MCA-leverende gebied), maar het heeft twee belangrijke beperkingen. 8 Het eerste voorbehoud is een zwakke tot nihil-respons op tPA-gemedieerde trombolytische behandeling, wat ook een nadeel is van het FeCl3-model 7,19,20. Het tweede voorbehoud van PTS- en FeCl3-beroertemodellen is dat de daaruit voortvloeiende trombi bestaan uit dicht opeengepakte bloedplaatjesaggregaten met een kleine hoeveelheid fibrine, wat niet alleen leidt tot de veerkracht tegen tPA-lytische therapie, maar ook afwijkt van het patroon van gemengde bloedplaatjes:fibrinetrombi bij patiënten met een acute ischemische beroerte21,22. Het in situ trombine-micro-injectiemodel daarentegen bestaat voornamelijk uit gepolymeriseerd fibrine en een onzeker gehalte aan bloedplaatjes10.
Gezien de bovenstaande redenering veronderstelden we dat vermenging van RB en een subtrombotische dosis trombine voor MCA-gerichte fotoactivering door verdunde schedel de fibrinecomponent in de resulterende trombi kan verhogen en de gevoeligheid voor tPA-gemedieerde lytische behandeling kan verhogen. We hebben deze hypothese bevestigd,23 en hierin beschrijven we gedetailleerde procedures van het gemodificeerde (T+RB) fototrombotische beroertemodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De traditionele RB fototrombotische beroerte, geïntroduceerd in 1985, is een aantrekkelijk model van focale cerebrale ischemie voor eenvoudige chirurgische ingrepen, lage mortaliteit en hoge reproduceerbaarheid van herseninfarct. 5 In dit model activeert de fotodynamische kleurstof RB snel bloedplaatjes bij lichtexcitatie, wat leidt tot dichte aggregaten die het bloedvat afsluiten 5,8,23. De kleine hoeve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies (NS108763, NS100419, NS095064 en HD080429 aan C.Y.K.; en NS106592 aan Y.Y.S.).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
