מודל שבץ פוטוטרומבוטי מועשר בפיברין ורגיש ל-tPA
Summary
מודלים מסורתיים של שבץ פוטוטרומבוטי (PTS) גורמים בעיקר לצברי טסיות צפופים בעלי עמידות גבוהה לטיפול ליטי במפעיל פלסמינוגן רקמתי (tPA). כאן מוצג מודל PTS מורין שונה על ידי הזרקה משותפת של תרומבין וצבע רגיש לאור לצורך פוטואקטיבציה. מודל PTS משופר תרומבין מייצר קרישי טסיות מעורבים:פיברין והוא רגיש מאוד לפקקת tPA.
Abstract
מודל שבץ טרומבואמבולי אידיאלי דורש תכונות מסוימות, כולל הליכים כירורגיים פשוטים יחסית עם תמותה נמוכה, גודל אוטם עקבי ומיקום, משקעים של טסיות:פיברין קרישי דם מעורבים דומים לאלה בחולים, ורגישות נאותה לטיפול פיברינוליטי. מודל שבץ פוטוטרומבוטי מבוסס צבע ורד בנגל (RB) עונה על שתי הדרישות הראשונות, אך הוא עמיד מאוד לטיפול ליטי בתיווך tPA, ככל הנראה בשל הרכב הקריש העשיר בטסיות אך דל בפיברין. אנו סבורים כי שילוב של צבע RB (50 מ”ג/ק”ג) ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין (80 U/kg) עבור פוטואקטיבציה המכוונת לענף הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA) עשוי לייצר קרישי דם מועשרים בפיברין ורגישים ל-tPA. ואכן, מודל הפוטוטרומבוזיס המשולב של טרומבין ו-RB (T+RB) גרם לקרישי דם מעורבים של טסיות דם:פיברין, כפי שמראים חיסונים ואימונובלוטים, ושמר על גדלים ומיקומים עקביים של אוטם בתוספת תמותה נמוכה. יתר על כן, הזרקה תוך ורידית של tPA (Alteplase, 10 מ”ג/ק”ג) תוך שעתיים לאחר הפוטואקטיבציה הפחיתה באופן משמעותי את גודל האוטם בפוטוטרומבוזיס T+RB. לפיכך, מודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין עשוי להיות מודל ניסיוני שימושי לבדיקת טיפולים טרומבוליטיים חדשניים.
Introduction
Endovascular thrombectomy ו- tPA-mediated thrombolysis הם שני הטיפולים היחידים שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לשבץ איסכמי חריף, אשר סובל ~ 700,000 חולים מדי שנה בארצות הברית1. מכיוון שהיישום של טרומבקטומיה מוגבל לחסימת כלי דם גדולים (LVO), בעוד tPA-thrombolysis עשוי להקל על חסימות כלי דם קטנים, שניהם טיפולים יקרי ערך של שבץ איסכמי חריף2. יתר על כן, השילוב של שני הטיפולים (למשל, התחלת tPA-thrombolysis בתוך 4.5 שעות מתחילת שבץ, ואחריו טרומבקטומיה) משפר את הרפרפוזיה ואת התוצאות התפקודיות3. לפיכך, אופטימיזציה של פקקת נותרה מטרה חשובה לחקר שבץ, גם בעידן של טרומבקטומיה.
מודלים טרומבואמבוליים הם כלי חיוני למחקר שבץ פרה-קליני שמטרתו לשפר טיפולים טרומבוליטיים. הסיבה לכך היא שמודלים מכניים של חסימת כלי דם (למשל, חסימת MCA בתפר תוך לומינלי) אינם מייצרים קרישי דם, וההתאוששות המהירה של זרימת הדם במוח לאחר הסרת החסימה המכנית היא אידיאליזציה מוגזמת 4,5. נכון להיום, מודלים טרומבואמבוליים עיקריים כוללים פוטוטרומבוזיס 6,7,8, כלוריד ברזל מקומי (FeCl3) יישום9, מיקרו-הזרקה של תרומבין לענף MCA 10,11, הזרקת אקס ויו (מיקרו)אמבולי לתוך MCA או עורק התרדמה המשותף (CCA)12,13,14, והיפוקסיה איסכמיה חולפת (tHI)15,16, 17,18. מודלים אלה של שבץ נבדלים זה מזה בהרכב ההיסטולוגי של קרישי הדם הבאים וברגישות לטיפולים ליטיים בתיווך tPA (טבלה 1). הם גם משתנים בדרישה הכירורגית של קרניוטומיה (דרושה להזרקת תרומבין באתרו וליישום מקומי של FeCl3), עקביות גודל אוטם ומיקום (למשל, עירוי CCA של מיקרואמבולי מניב תוצאות משתנות מאוד), והשפעות גלובליות על מערכת הלב וכלי הדם (למשל, tHI מגביר את קצב הלב ואת תפוקת הלב כדי לפצות על התרחבות כלי דם היקפית הנגרמת על ידי היפוקסיה).
למודל שבץ פוטוטרומבוטי מבוסס צבע RB (PTS) יש תכונות אטרקטיביות רבות, כולל הליכים כירורגיים פשוטים ללא קרניוטומיה, תמותה נמוכה (בדרך כלל < 5%), וגודל ומיקום צפויים של אוטם (בשטח אספקת MCA), אך יש לו שתי מגבלות עיקריות. 8 האזהרה הראשונה היא תגובה חלשה עד אפסית לטיפול תרומבוליטי בתיווך tPA, שהוא גם חיסרון של FeCl3 מודל 7,19,20. האזהרה השנייה של מודלים של שבץ מוחי PTS ו- FeCl3 היא שהטרומבי שנוצר כתוצאה מכך מורכב מאגרגטים צפופים של טסיות עם כמות קטנה של פיברין, אשר לא רק מובילים לעמידותו לטיפול tPA-lytic, אלא גם חורגים מהדפוס של טסיות מעורבות:תרומבי פיברין בחולי שבץ איסכמי חריף21,22. לעומת זאת, מודל המיקרו-הזרקה באתרו כולל בעיקר פיברין פולימרי ותכולה לא ודאית של טסיות10.
בהתחשב בהנמקה לעיל, שיערנו כי תערובת של RB ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין עבור פוטואקטיבציה ממוקדת MCA באמצעות גולגולת מדוללת עשויה להגדיל את מרכיב הפיברין בטרומבי שנוצר ולהגביר את הרגישות לטיפול ליטי בתיווך tPA. איששנו השערה זו,23 וכאן אנו מתארים הליכים מפורטים של מודל שבץ פוטוטרומבוטי שונה (T+RB).
Protocol
Representative Results
Discussion
שבץ פוטוטרומבוטי RB מסורתי, שהוצג בשנת 1985, הוא מודל אטרקטיבי של איסכמיה מוחית מוקדית עבור הליכים כירורגיים פשוטים, תמותה נמוכה, ושחזור גבוה של אוטם מוחי. 5 במודל זה, הצבע הפוטודינמי RB מפעיל במהירות טסיות דם עם עירור אור, מה שמוביל לצברים צפופים החוסמים את כלי הדם 5,8,23…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ה-NIH (NS108763, NS100419, NS095064 ו-HD080429 ל-C.Y. K. ו-NS106592 ל-Y.Y.S).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
