В Vivo CRISPR/Cas9 Скрининг для одновременной оценки функции гена в коже мыши и полости рта

Одна из проблем для исследований рака в пост-геномную эпоху заключается в том, чтобы добывать огромное количество данных генома для причинно-следственных мутаций генов и выявлять узлы в генной сети, которые могут быть направлены терапевтически. Хотя биоинформатический анализ очень помог в достижении этих целей, создание эффективных моделей in vitro и in vivo является необходимым условием для расшифровки сложности биологических систем и состояний болезней и обеспечения разработки лекарственных средств. В то время как обычные трансгенные модели мыши широко используются для исследований генетики рака in vivo, их затратный, трудоемкий характер в значительной степени запрещает систематический анализ сотен генов лечения рака, разгаданых современной геномикой. Чтобы преодолеть это узкое место, мы объединили ранее установленную ультразвуковую методику^{редактирования утеро-инъекций 1,2} с CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)^{технологией редактирования генов 3, чтобы} одновременно вызвать и изучить потерю функциональных мутаций сотен генов в коже и полости рта одной мыши.

Описанная здесь методология использует ультразвуковые инъекции инженерных лентивирусов в амниотической полости живых эмбрионов мыши в эмбриональный день E9.5. Лентивирусный груз, содержащий компоненты CRISPR/Cas9, трансдуцирован однослойным поверхностным эктодермом, что впоследствии приводит к эпителию кожи и полости рта. Кожа состоит из внешнего эпидермиса, за которым следуют мембрана подвала и дерма. Эпидермис представляет 16-й стратифицированный эпителий, состоящий из внутреннего базального слоя, который поддерживает контакт с мембраной подвала и имеет пролиферативную и стволовую способность. Базальный слой приводит к дифференцированным слоям выше, таким как спиновые, гранулированные и слои роговицы^2,4. Исследования отслеживания линий показывают, что этот метод прямого in vivo CRISPR/Cas9 генетически манипулирует стволовыми клетками резидентов тканей в базальной слое, которые сохраняются на протяжении всей взрослой жизни. Поскольку лентивирус можно заценит для трансдукирования эктодерма поверхности E9.5 при клональной плотности, этот метод может быть использован для генерации мозаичных мышей, укрывающих тысячи дискретных генных нокаутированных клонов. Следующее поколение секвенирования может быть использовано для анализа эффекта CRISPR/Cas9-опосредованная абляция генов в этих клонов в мультиплексной^{манере 5}.

Недавно мы использовали этот метод для оценки функции 484 генов, которые показывают периодические мутации в человеческой голове и шее плоскоклеточной карциномы (HNSCC)⁵. HNSCC является разрушительным раком с высоким уровнем смертности 40-50%, и это^{6-й наиболее распространенный рак} во всем мире⁶. HNSCC возникают в слизистой оболочки верхних дыхательных путей или полости рта и связаны с потреблением табака и алкоголя или вирус папилломы человека (ВПЧ) инфекции. Кожные плоскоклеточный рак (SCC) являются опухоли кожи и представляют собой второй наиболее распространенный рак у людей⁷. Кожные SCC и HNSCC являются гистограммо и молекулярно очень похожи, с высоким процентом случаев, выставленных изменения в TP53, PIK3CA, NOTCH1, и HRAS⁸. Хотя существует лишь горстка генов, мутировавших на высокой частоте, существуют сотни генов, мутировавших на низкой частоте (Lt; 5%), явление, обычно называемое распределением длиннохвостых. Поскольку большинство длиннохвостых генов не имеют биологической или клинической проверки, мы использовали эту технологию скрининга in vivo CRISPR для моделирования потери функции этих генов у опухолевых мышей с сенсибилизирующими мутациями в p53, Pik3ca или Hras и определили несколько новых генов супрессоров опухолей, которые сотрудничают с p53, Pik3ca или Hras, ^{чтобы вызвать развитие опухоли 5.}

Здесь мы описываем подробный протокол для создания мультиплексных библиотек sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA и выполнения экранов выкриков гена CRISPR/Cas9 в эктодерме поверхности мыши. Следует отметить, что эта методология может быть адаптирована для включения других технологий манипуляции генами, таких как активация CRISPR (CRISPRa) и инактивация CRISPR (CRISPRi) или изменена для целевой других систем органов в мыши для изучения функций генов.