Hier beschrijven we een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echogeleide in utero embryonale lentivirale injecties om tegelijkertijd functies van verschillende genen in de huid en mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.
Genetisch gemodificeerde muismodellen (GEMM) hebben een belangrijke rol gespeeld bij het beoordelen van de genfunctie, het modelleren van menselijke ziekten en dienen als preklinisch model om therapeutische wegen te beoordelen. Hun tijd-, arbeids- en kostenintensieve aard beperkt echter hun nut voor systematische analyse van de genfunctie. Recente vooruitgang in genoombewerkingstechnologieën overwint deze beperkingen en maakt het mogelijk om op een multiplexed en snelle manier snelle generatie van specifieke genperturbaties rechtstreeks in specifieke muisorganen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een CRISPR/Cas9-gebaseerde methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) om duizenden gen knock-out klonen te genereren in het epitheel van de huid en mondholte van muizen, en bieden we een protocol met de stappen die nodig zijn om een direct in vivo CRISPR-scherm uit te voeren voor tumoronderdrukkergenen. Deze aanpak kan worden toegepast op andere organen of andere CRISPR/Cas9-technologieën zoals CRISPR-activering of CRISPR-inactivatie om de biologische functie van genen tijdens weefselhomeostase of in verschillende ziekte-instellingen te bestuderen.
Een van de uitdagingen voor kankeronderzoek in het post-genomische tijdperk is het ontginnen van de enorme hoeveelheid genoomgegevens voor causale genmutaties en het identificeren van knooppunten in het gennetwerk die therapeutisch kunnen worden gericht. Hoewel bioinformatische analyses enorm hebben bijgedragen aan deze doelen, is het opzetten van efficiënte in vitro en in vivo modellen een voorwaarde om de complexiteit van biologische systemen en ziektetoestanden te ontcijferen en de ontwikkeling van geneesmiddelen mogelijk te maken. Terwijl conventionele transgene muismodellen uitgebreid zijn gebruikt voor in vivo kankergeneticastudies, heeft hun kosten-, tijd- en arbeidsintensieve aard de systematische analyse van de honderden putatieve kankergenen die door de moderne genomica zijn ontrafeld, grotendeels verboden. Om dit knelpunt te overwinnen, combineerden we een eerder vastgestelde echografie-geleide in utero-injectiemethodologie1,2 met een CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genbewerkingstechnologie3 om tegelijkertijd verlies van functiemutaties van honderden genen in de huid en mondholte van een enkele muis te induceren en te bestuderen.
De hier beschreven methodologie maakt gebruik van ultrageluidgeleide injecties van gemanipuleerde lentivirussen in de vruchtholte van levende muisembryo’s op embryonale dag E9.5. De lentivirale lading met CRISPR/Cas9 componenten transduceert het enkellaagse oppervlak ectoderm, wat later aanleiding geeft tot het epitheel van de huid en mondholte. De huid bestaat uit een buitenste epidermis, gevolgd door keldermembraan en dermis. Epidermis is een gelaagd epitheel dat bestaat uit een binnenste, basale laag, die contact houdt met het keldermembraan en proliferatieve en stamcelcapaciteit heeft. De basale laag geeft aanleiding tot de gedifferentieerde lagen hierboven, zoals spineuze, korrelige en stratum corneumlagen2,4. Lineage tracing studies tonen aan dat deze directe in vivo CRISPR/Cas9 methode genetisch weefsel-resident stamcellen manipuleert binnen de basale laag die gedurende de volwassenheid aanhoudt. Aangezien lentivirus kan worden getitreerd om het E9.5-oppervlakte-ectoderm bij klonale dichtheid over te brengen, kan deze methode worden gebruikt om mozaïekmuizen te genereren die duizenden discrete gen knock-out klonen herbergen. Next generation sequencing kan vervolgens worden gebruikt om het effect van CRISPR/Cas9-gemedieerde genablatie binnen die klonen op een multiplexed manier te analyseren5.
We hebben deze methode onlangs gebruikt om de functie te beoordelen van 484 genen die terugkerende mutaties vertonen in humaan plaveiselcelcarcinoom (HNSCC)5. HNSCC is een verwoestende kanker met een hoog sterftecijfer van 40-50% en het is de6e meest voorkomende kanker wereldwijd6. HNSCC ontstaat in mucosale bekledingen van de bovenste luchtwegen of mondholte en wordt geassocieerd met tabaks- en alcoholgebruik of infectie met humaan papillomavirus (HPV). Cutaan plaveiselcelcarcinoom (SCC) zijn huidtumoren en vertegenwoordigen de op een na meest voorkomende kanker bij mensen7. Cutane SCC en HNSCC lijken histologisch en moleculair erg op elkaar, met een hoog percentage gevallen dat veranderingen vertoont in TP53, PIK3CA, NOTCH1 en HRAS8. Hoewel er slechts een handvol genen gemuteerd zijn met hoge frequentie, zijn er honderden genen gemuteerd gevonden bij lage frequentie (< 5%), een fenomeen dat gewoonlijk de long-tail distributie wordt genoemd. Omdat de meerderheid van de long-tail genen biologische of klinische validatie mist, gebruikten we deze in vivo CRISPR screening technologie om functieverlies van deze genen te modelleren bij tumorgevoelige muizen met sensibiliserende mutaties in p53, Pik3ca of Hras en identificeerden we verschillende nieuwe tumor suppressor genen die samenwerken met p53, Pik3ca of Hras om tumorontwikkeling te triggeren5.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA-bibliotheken te genereren en CRISPR / Cas9-gen knock-outschermen in het ectoderm van het muisoppervlak uit te voeren. Deze methodologie kan worden aangepast om andere genmanipulatietechnologieën op te nemen, zoals CRISPR-activering (CRISPRa) en CRISPR-inactivatie (CRISPRi), of worden aangepast om andere orgaansystemen in de muis te targeten om genfuncties te bestuderen.
CRISPR/Cas9 genoombewerking is veel gebruikt in in vitro en in vivo studies om genfuncties en cellulaire processen te onderzoeken. De meeste in vivo studies maken gebruik van CRISPR/Cas9 gen bewerkte cellen geënt in een diermodel (allograft of xenograft). Hoewel dit een krachtig hulpmiddel is om kankergenetica en cellulaire functies te bestuderen, mist het nog steeds het micromilieu van het inheemse weefsel en kan het wond- en / of immuunreacties opwekken.
Om deze uitdagingen het hoofd te bie…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie van het Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), de Krembil Foundation en het Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan is de ontvanger van een Canadian Cancer Society fellowship (BC-F-16#31919).
0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
15 cm cell culture plates | Corning | ||
293FT | Invitrogen | R70007 | |
293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
ATP | NEB | 9804S | |
BsmBI | NEB | R0580L | |
Chromic gut suture | Covidien | ||
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
Permoplast modeling clay | |||
Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
Semicircular Silicone plug | Corning | ||
Silicone membrane | Visual Sonics | ||
T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |