Summary

In Vivo CRISPR/Cas9-screening om tegelijkertijd de genfunctie in de huid en mondholte van de muis te evalueren

Published: November 02, 2020
doi:

Summary

Hier beschrijven we een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echogeleide in utero embryonale lentivirale injecties om tegelijkertijd functies van verschillende genen in de huid en mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.

Abstract

Genetisch gemodificeerde muismodellen (GEMM) hebben een belangrijke rol gespeeld bij het beoordelen van de genfunctie, het modelleren van menselijke ziekten en dienen als preklinisch model om therapeutische wegen te beoordelen. Hun tijd-, arbeids- en kostenintensieve aard beperkt echter hun nut voor systematische analyse van de genfunctie. Recente vooruitgang in genoombewerkingstechnologieën overwint deze beperkingen en maakt het mogelijk om op een multiplexed en snelle manier snelle generatie van specifieke genperturbaties rechtstreeks in specifieke muisorganen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een CRISPR/Cas9-gebaseerde methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) om duizenden gen knock-out klonen te genereren in het epitheel van de huid en mondholte van muizen, en bieden we een protocol met de stappen die nodig zijn om een direct in vivo CRISPR-scherm uit te voeren   voor tumoronderdrukkergenen. Deze aanpak kan worden toegepast op andere organen of andere CRISPR/Cas9-technologieën zoals CRISPR-activering of CRISPR-inactivatie om de biologische functie van genen tijdens weefselhomeostase of in verschillende ziekte-instellingen te bestuderen.

Introduction

Een van de uitdagingen voor kankeronderzoek in het post-genomische tijdperk is het ontginnen van de enorme hoeveelheid genoomgegevens voor causale genmutaties en het identificeren van knooppunten in het gennetwerk die therapeutisch kunnen worden gericht. Hoewel bioinformatische analyses enorm hebben bijgedragen aan deze doelen, is het opzetten van efficiënte in vitro en in vivo modellen een voorwaarde om de complexiteit van biologische systemen en ziektetoestanden te ontcijferen en de ontwikkeling van geneesmiddelen mogelijk te maken. Terwijl conventionele transgene muismodellen uitgebreid zijn gebruikt voor in vivo kankergeneticastudies, heeft hun kosten-, tijd- en arbeidsintensieve aard de systematische analyse van de honderden putatieve kankergenen die door de moderne genomica zijn ontrafeld, grotendeels verboden. Om dit knelpunt te overwinnen, combineerden we een eerder vastgestelde echografie-geleide in utero-injectiemethodologie1,2 met een CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genbewerkingstechnologie3 om tegelijkertijd verlies van functiemutaties van honderden genen in de huid en mondholte van een enkele muis te induceren en te bestuderen.

De hier beschreven methodologie maakt gebruik van ultrageluidgeleide injecties van gemanipuleerde lentivirussen in de vruchtholte van levende muisembryo’s op embryonale dag E9.5. De lentivirale lading met CRISPR/Cas9 componenten transduceert het enkellaagse oppervlak ectoderm, wat later aanleiding geeft tot het epitheel van de huid en mondholte. De huid bestaat uit een buitenste epidermis, gevolgd door keldermembraan en dermis. Epidermis is een gelaagd epitheel dat bestaat uit een binnenste, basale laag, die contact houdt met het keldermembraan en proliferatieve en stamcelcapaciteit heeft. De basale laag geeft aanleiding tot de gedifferentieerde lagen hierboven, zoals spineuze, korrelige en stratum corneumlagen2,4. Lineage tracing studies tonen aan dat deze directe in vivo CRISPR/Cas9 methode genetisch weefsel-resident stamcellen manipuleert binnen de basale laag die gedurende de volwassenheid aanhoudt. Aangezien lentivirus kan worden getitreerd om het E9.5-oppervlakte-ectoderm bij klonale dichtheid over te brengen, kan deze methode worden gebruikt om mozaïekmuizen te genereren die duizenden discrete gen knock-out klonen herbergen. Next generation sequencing kan vervolgens worden gebruikt om het effect van CRISPR/Cas9-gemedieerde genablatie binnen die klonen op een multiplexed manier te analyseren5.

We hebben deze methode onlangs gebruikt om de functie te beoordelen van 484 genen die terugkerende mutaties vertonen in humaan plaveiselcelcarcinoom (HNSCC)5. HNSCC is een verwoestende kanker met een hoog sterftecijfer van 40-50% en het is de6e meest voorkomende kanker wereldwijd6. HNSCC ontstaat in mucosale bekledingen van de bovenste luchtwegen of mondholte en wordt geassocieerd met tabaks- en alcoholgebruik of infectie met humaan papillomavirus (HPV). Cutaan plaveiselcelcarcinoom (SCC) zijn huidtumoren en vertegenwoordigen de op een na meest voorkomende kanker bij mensen7. Cutane SCC en HNSCC lijken histologisch en moleculair erg op elkaar, met een hoog percentage gevallen dat veranderingen vertoont in TP53, PIK3CA, NOTCH1 en HRAS8. Hoewel er slechts een handvol genen gemuteerd zijn met hoge frequentie, zijn er honderden genen gemuteerd gevonden bij lage frequentie (< 5%), een fenomeen dat gewoonlijk de long-tail distributie wordt genoemd. Omdat de meerderheid van de long-tail genen biologische of klinische validatie mist, gebruikten we deze in vivo CRISPR screening technologie om functieverlies van deze genen te modelleren bij tumorgevoelige muizen met sensibiliserende mutaties in p53, Pik3ca of Hras en identificeerden we verschillende nieuwe tumor suppressor genen die samenwerken met p53, Pik3ca of Hras om tumorontwikkeling te triggeren5.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA-bibliotheken te genereren en CRISPR / Cas9-gen knock-outschermen in het ectoderm van het muisoppervlak uit te voeren. Deze methodologie kan worden aangepast om andere genmanipulatietechnologieën op te nemen, zoals CRISPR-activering (CRISPRa) en CRISPR-inactivatie (CRISPRi), of worden aangepast om andere orgaansystemen in de muis te targeten om genfuncties te bestuderen.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC van de Universiteit van Toronto. 1. Ontwerp en klonen van gepoolde CRISPR-bibliotheken Selecteer 4-5 sgRNAs die zich richten op muisgenen die interessant zijn uit bronnen zoals de SgRNA-ontwerper van het Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) of de CHOPCHOP-server (https://chopchop.cbu.uib.no). Selecteer een gelijk aantal sgRNAs zonder targeting uit bijvoor…

Representative Results

Figuur 1A toont het ontwerp van de oligonucleotiden voor het op een kosteneffectieve manier multiplexen van verschillende aangepaste CRISPR-bibliotheken in een enkele oligochip van 12k of 92k. Zodra de sgRNAs (blauwe kleur gecodeerd) zijn geselecteerd, worden de oligonucleotiden ontworpen met beperkingsplaatsen (oranje gekleurde BsmBI) en bibliotheekspecifieke PCR-primerparen (groene kleur gecodeerd). Verschillende bibliotheken kunnen worden ontworpen met behulp van een unieke combinatie van…

Discussion

CRISPR/Cas9 genoombewerking is veel gebruikt in in vitro en in vivo studies om genfuncties en cellulaire processen te onderzoeken. De meeste in vivo studies maken gebruik van CRISPR/Cas9 gen bewerkte cellen geënt in een diermodel (allograft of xenograft). Hoewel dit een krachtig hulpmiddel is om kankergenetica en cellulaire functies te bestuderen, mist het nog steeds het micromilieu van het inheemse weefsel en kan het wond- en / of immuunreacties opwekken.

Om deze uitdagingen het hoofd te bie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie van het Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), de Krembil Foundation en het Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan is de ontvanger van een Canadian Cancer Society fellowship (BC-F-16#31919).

Materials

0.45 micron filter Sigma S2HVU02RE
12k or 92k oligo chip Customarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture plates Corning
293FT Invitrogen R70007
293NT Systems Biosciences LV900A-1
Alkaline phosphatase NEB M0290L
Amplicillin Fisher Scientific BP1760-25
ATP NEB 9804S
BsmBI NEB R0580L
Chromic gut suture Covidien
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) Illumina
DNA-cleanup kit Zymo Research D4008
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit Qiagen 69506
Endura electrocompetent cells Lucigen 60242-1
Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
HEK293T cells ATCC CRL-3216
High-Speed Centrifuge Beckman Coulter MLS-50
LB Agar Wisent Technologies 800-011-LG
Micropipette puller Sutter Instrument P97
Mineral oil Sigma M5904
Mini-prep plasmid Kit Frogga Bio PDH300
Mouse oxygen anaesthesia system Visual Sonics
Nanoject II micromanipulator Drummond
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) NEB R0580L
Needle sharpener Sutter Instrument BV-10
Oligo cleanup kit Zymo research D4060
PAGE purified illumina sequencing primer IDT DNA
PEI (polyethyleneimine) Sigma 408727-100ML
Permoplast modeling clay
Petridish with central opening Visual Sonics
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
Q5 Polymerase 2x Master mix NEB M0494L
Qubit Fluorometric Quantification Invitrogen Q33327
Semicircular Silicone plug Corning
Silicone membrane Visual Sonics
T4 DNA ligase NEB M0202L
Ultra-centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Vevo2000 ultrasound system Visual Sonics

References

  1. Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
  2. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
  3. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  4. Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
  5. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
  6. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
  7. Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
  8. Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
  9. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
  10. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  11. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  14. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
  15. Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
  16. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
  17. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
  18. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
  19. Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
  20. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).

Play Video

Cite This Article
Loganathan, S. K., Malik, A., Langille, E., Luxenburg, C., Schramek, D. In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity. J. Vis. Exp. (165), e61693, doi:10.3791/61693 (2020).

View Video