Screening CRISPR/Cas9 in vivo per valutare contemporaneamente la funzione genica nella pelle del topo e nella cavità orale

Una delle sfide per la ricerca sul cancro nell’era post-genomica è estrarre la grande quantità di dati genomici per le mutazioni geniche causali e identificare i nodi nella rete genica che possono essere mirati terapeuticamente. Mentre le analisi bioinformatiche hanno contribuito immensamente a raggiungere questi obiettivi, stabilire modelli efficienti in vitro e in vivo è un prerequisito per decifrare la complessità dei sistemi biologici e degli stati delle malattie e per consentire lo sviluppo di farmaci. Mentre i modelli convenzionali di topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studi di genetica del cancro in vivo, la loro natura ad alta intensità di costi, tempo e lavoro ha ampiamente vietato l’analisi sistematica delle centinaia di geni del cancro putativo non rivelato dalla genomica moderna. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo combinato una tecnologia di editing genica guidata da ultrasuoni precedentemente stabilita nella metodologia di iniezione utero^1,2 con una tecnologia di editing genico CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)^{3 per} indurre e studiare simultaneamente mutazioni di perdita di funzione di centinaia di geni nella pelle e nella cavità orale di un singolo topo.

La metodologia qui descritta utilizza iniezioni guidate da ultrasuoni di lentivirus ingegnerizzati nella cavità amniotica degli embrioni di topo viventi al giorno embrionale E9.5. Il carico lentivirale contenente componenti CRISPR/Cas9 trasduce l’ectoderma superficiale monostrato, che successivamente dà origine all’epitelio della pelle e della cavità orale. La pelle è composta da un’epidermide esterna, seguita da membrana basale e derma. L’epidermide è un epitelio stratificato composto da uno strato interno basale, che mantiene il contatto con la membrana basale e ha capacità proliferativa e cellulare. Lo strato basale dà origine agli strati differenziati sopra come strati spinosi, granulari e strato corneo^2,4. Studi di tracciamento del lignaggio mostrano che questo metodo CRISPR/Cas9 in vivo diretto manipola geneticamente le cellule staminali residenti nei tessuti all’interno dello strato basale che persistono per tutta l’età adulta. Poiché il lentivirus può essere titolato per trasdurre l’ectoderma superficiale E9.5 a densità clonale, questo metodo può essere utilizzato per generare topi mosaico che ospitano migliaia di cloni discreti a knock-out genico. Il sequenziamento di nuova generazione può quindi essere utilizzato per analizzare l’effetto dell’ablazione genica mediata da CRISPR /Cas9 all’interno di tali cloni in modo^{multiplexato 5}.

Recentemente abbiamo utilizzato questo metodo per valutare la funzione di 484 geni che mostrano mutazioni ricorrenti nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo umano (HNSCC)⁵. L’HNSCC è un cancro devastante con un alto tasso di mortalità del 40-50% ed è il⁶ ° cancro più comune in tutto il^{mondo 6}. L’HNSCC si presenta nei rivestimenti mucosi delle vie aeree superiori o della cavità orale e sono associati al consumo di tabacco e alcol o all’infezione da papillomavirus umano (HPV). Il carcinoma a cellule squamose cutanee (SCC) sono tumori della pelle e rappresentano il secondo tumore più comune nell’uomo⁷. Cutaneous SCC e HNSCC sono istologicamente e molecolarmente molto simili, con un’alta percentuale di casi che presentano alterazioni in TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS⁸. Mentre ci sono solo una manciata di geni mutati ad alta frequenza, ci sono centinaia di geni trovati mutati a bassa frequenza (< 5%), un fenomeno comunemente indicato come distribuzione a coda lunga. Poiché la maggior parte dei geni a coda lunga manca di convalida biologica o clinica, abbiamo utilizzato questa tecnologia di screening CRISPR in vivo per modellare la perdita di funzione di questi geni nei topi soggetti a tumore con mutazioni sensibilizzanti in p53, Pik3ca o Hras e identificato diversi nuovi geni soppressori del tumore che collaborano con p53, Pik3ca o Hras per innescare lo sviluppo tumorale⁵.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per generare librerie di sgRNA CRISPR lentivirale sgRNA multiplexato ed eseguire schermi di knock-out genico CRISPR / Cas9 nell’ectoderma della superficie del mouse. Da notare che questa metodologia può essere adattata per incorporare altre tecnologie di manipolazione genica come l’attivazione CRISPR (CRISPRa) e l’inattivazione CRISPR (CRISPRi) o modificata per indirizzare altri sistemi di organi nel topo per studiare le funzioni geniche.