Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

Um dos desafios para a pesquisa do câncer na era pós-genômica é minerar a vasta quantidade de dados de genoma para mutações genéticas causais e identificar nós na rede genética que podem ser direcionados terapeuticamente. Embora as análises bioinformáticas tenham ajudado imensamente nesse sentido, estabelecer modelos in vitro e in vivo eficientes é um pré-requisito para decifrar a complexidade dos sistemas biológicos e estados de doenças e para permitir o desenvolvimento de medicamentos. Embora os modelos convencionais de camundongos transgênicos tenham sido usados extensivamente para estudos de genética do câncer in vivo, sua natureza de custo, tempo e trabalho intensivo proibiu em grande parte a análise sistemática das centenas de genes putativos de câncer desvendados pela genômica moderna. Para superar esse gargalo, combinamos uma tecnologia de edição de genes previamente estabelecida no ultrassom na metodologia de injeção do útero^1,2 com uma tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)^para induzir e estudar simultaneamente mutações de perda de função de centenas de genes na pele e cavidade oral de um único rato.

A metodologia descrita aqui utiliza injeções guiadas por ultrassom de lentivírus projetados na cavidade amniótica de embriões de camundongos vivos no dia embrionário E9.5. A carga lentiviral contendo componentes CRISPR/Cas9 transduzir o ectoderme de superfície em camada única, que mais tarde dá origem ao epitélio da pele e da cavidade oral. A pele é composta de uma epiderme externa, seguida por membrana do porão e derme. Epiderme é um epitélio estratificado composto por uma camada interna basal, que mantém contato com a membrana do porão e tem capacidade proliferativa e de células-tronco. A camada basal dá origem às camadas diferenciadas acima, como camadas de córneas espinhosas, granulares e^{estratosas 2,4}. Estudos de rastreamento de linhagem mostram que este método in vivo CRISPR/Cas9 manipula geneticamente células-tronco residentes em tecidos dentro da camada basal que persistem durante toda a idade adulta. Como o lentivírus pode ser titulado para transduturar o ectoderm superficial E9.5 na densidade clonal, este método pode ser usado para gerar ratos de mosaico abrigando milhares de clones de knock-out genéticos discretos. O sequenciamento da próxima geração pode então ser usado para analisar o efeito da ablação genética mediada pelo CRISPR/Cas9 dentro desses clones de forma multiplexada⁵.

Recentemente, utilizamos este método para avaliar a função de 484 genes que mostram mutações recorrentes no Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço Humano (HNSCC)⁵. O HNSCC é um câncer devastador com uma alta taxa de mortalidade de 40 a 50% e é o^6º câncer mais comum em todo o mundo⁶. O HNSCC surge em forros mucosas das vias aéreas superiores ou da cavidade oral e está associado ao consumo de tabaco e álcool ou infecção por papilomavírus humano (HPV). Carcinoma de Células Escamosas Cutâneas (CCS) são tumores de pele e representam o segundo câncer mais comum em humanos⁷. O CCS cutâneo e o HNSCC são histologicamente e molecularmente muito semelhantes, com um alto percentual de casos apresentando alteração em TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS⁸. Embora haja apenas um punhado de genes mutados em alta frequência, há centenas de genes encontrados mutados em baixa frequência (< 5%), um fenômeno comumente referido como a distribuição de cauda longa. Como a maioria dos genes de cauda longa não tem validação biológica ou clínica, usamos esta tecnologia de triagem in vivo CRISPR para modelar a perda de função desses genes em camundongos propensos a tumores com mutações sensibilizantes em p53, Pik3ca ou Hras e identificamos vários novos genes supressores de tumores que cooperam com p53, Pikca ou Hras para desencadear o desenvolvimento do tumor⁵.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para gerar bibliotecas sgRNA lentiviral sgRNA multiplexed sgRNA e executar telas de knock-out de genes CRISPR/Cas9 no ectoderme da superfície do mouse. Note-se que essa metodologia pode ser adaptada para incorporar outras tecnologias de manipulação genética, como a ativação crispr (CRISPRa) e a inativação CRISPR (CRISPRi) ou modificada para atingir outros sistemas de órgãos no mouse para estudar funções genéticas.