Dépistage in Vivo CRISPR/Cas9 pour évaluer simultanément la fonction génétique dans la peau de la souris et la cavité buccale

L’un des défis de la recherche sur le cancer à l’ère postgénomique est d’extraire la grande quantité de données génomiques pour les mutations génétiques causales et d’identifier les nœuds du réseau génétique qui peuvent être ciblés thérapeutiquement. Alors que les analyses bioinformatiques ont énormément contribué à atteindre ces objectifs, l’établissement de modèles in vitro et in vivo efficaces est une condition préalable pour déchiffrer la complexité des systèmes biologiques et des états de la maladie et pour permettre le développement de médicaments. Alors que les modèles conventionnels de souris transgéniques ont été largement utilisés pour les études génétiques in vivo sur le cancer, leur nature à forte intensité de coût, de temps et de main-d’œuvre a largement interdit l’analyse systématique des centaines de gènes du cancer putatifs démêlés par la génomique moderne. Pour surmonter ce goulot d’étranglement, nous avons combiné une méthodologie d’injection in utero guidée par ultrasons^{précédemment établie 1,2} avec une technologie d’édition de gènes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)³ pour induire et étudier simultanément des mutations de perte de fonction de centaines de gènes dans la peau et la cavité buccale d’une seule souris.

La méthodologie décrite ici utilise des injections guidées par ultrasons de lentivirus modifiés dans la cavité amniotique des embryons vivants de souris au jour embryonnaire E9.5. La cargaison lentivirale contenant des composants CRISPR/Cas9 transduisent l’ectoderm de surface à une seule couche, ce qui donne plus tard naissance à l’épithélium de la peau et de la cavité buccale. La peau est composée d’un épiderme externe, suivi d’une membrane et d’un derme du sous-sol. Epidermis est un épithélium stratifié composé d’une couche interne basale, qui maintient le contact avec la membrane du sous-sol et a une capacité proliférative et de cellules souches. La couche basale donne lieu aux couches différenciées ci-dessus telles que les couches de cornée épineuses, granulaires et stratiques^2,4. Les études de traçage de lignée ment montrent que cette méthode directe in vivo CRISPR/Cas9 manipule génétiquement les cellules souches résidentes des tissus dans la couche basale qui persistent tout au long de l’âge adulte. Comme le lentivirus peut être titré pour transduire l’ectoderme de surface E9.5 à la densité clonale, cette méthode peut être utilisée pour générer des souris mosaïques hébergeant des milliers de clones discrets knock-out gène. Le séquençage de prochaine génération peut ensuite être utilisé pour analyser l’effet de l’ablation des gènes crispr/cas9 dans ces clones d’une manière multiplexée⁵.

Nous avons récemment utilisé cette méthode pour évaluer la fonction de 484 gènes qui montrent des mutations récurrentes dans le carcinome épilemous de tête et de cou humain (HNSCC)^5. HNSCC est un cancer dévastateur avec un taux de mortalité élevé de 40-50% et il est^{le 6ème} cancer le plus commun dans^{le monde entier 6}. Le HNSCC se présente dans les muqueux des voies respiratoires supérieures ou de la cavité buccale et est associé à la consommation de tabac et d’alcool ou à l’infection par le virus du papillome humain (VPH). Le carcinome cutané de cellules squamous (CSC) sont des tumeurs de peau et représentent le deuxième cancer le plus commun chez l’homme^7. Le CSC cutané et le HNSCC sont histologiquement et moléculairement très semblables, avec un pourcentage élevé de cas présentant l’altération dans TP53, PIK3CA, NOTCH1, et HRAS^8. Bien qu’il n’y ait qu’une poignée de gènes mutés à haute fréquence, il existe des centaines de gènes trouvés mutés à basse fréquence (et 5 %), un phénomène communément appelé la distribution à longue queue. Comme la majorité des gènes à longue queue n’ont pas de validation biologique ou clinique, nous avons utilisé cette technologie de dépistage IN vivo CRISPR pour modéliser la perte de fonction de ces gènes chez les souris sujettes aux tumeurs avec des mutations sensibilisantes dans p53, Pik3ca ou Hras et identifié plusieurs nouveaux gènes suppresseurs de tumeur qui coopèrent avec p53, Pik3ca ou Hras pour déclencher le développement^{tumoral 5}.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour générer des bibliothèques de sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA multiplexed et effectuer crispr/cas9 gène knock-out écrans dans l’ectoderm surface de la souris. Il convient de noter que cette méthodologie peut être adaptée pour intégrer d’autres technologies de manipulation génétique telles que l’activation CRISPR (CRISPRa) et l’inactivation CRISPR (CRISPRi) ou modifiée pour cibler d’autres systèmes organiques chez la souris pour étudier les fonctions génétiques.