In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

Uno de los desafíos para la investigación del cáncer en la era post-genómica es extraer la gran cantidad de datos del genoma para mutaciones genéticas causales e identificar nodos en la red genética que pueden ser dirigidos terapéuticamente. Si bien los análisis bioinformáticas han ayudado enormemente hacia estos objetivos, establecer modelos eficientes in vitro e in vivo es un requisito previo para descifrar la complejidad de los sistemas biológicos y los estados de enfermedades y para permitir el desarrollo de fármacos. Si bien los modelos convencionales de ratón transgénico se han utilizado ampliamente para estudios genéticos in vivo sobre el cáncer, su naturaleza intensiva en costos, tiempo y mano de obra ha prohibido en gran medida el análisis sistemático de los cientos de genes cancerosos putativos desentrañados por la genómica moderna. Para superar este cuello de botella, combinamos una tecnología de edición genética^1,2 con una tecnología de edición de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)³ para inducir y estudiar simultáneamente mutaciones de pérdida de función de cientos de genes en la piel y cavidad oral de un solo ratón.

La metodología descrita aquí utiliza inyecciones guiadas por ultrasonido de lentivirus de ingeniería en la cavidad amniótica de embriones de ratón vivos en el día embrionario E9.5. La carga lentiviral que contiene componentes CRISPR/Cas9 transduce el ectodermo superficial de una sola capa, que más tarde da lugar al epitelio de la piel y la cavidad oral. La piel se compone de una epidermis externa, seguida de membrana y dermis del sótano. Epidermis es un epitelio estratificado compuesto por una capa interior basal, que mantiene contacto con la membrana del sótano y tiene capacidad proliferativa y de células madre. La capa basal da lugar a las capas diferenciadas anteriores, como las capas de córneo espinosas, granulares y estrato^2,4. Estudios de rastreo de linaje muestran que este método crispr/cas9 in vivo directo manipula genéticamente las células madre residentes en tejidos dentro de la capa basal que persisten a lo largo de la edad adulta. Como el lentivirus se puede valorar para transducir el ectodermo superficial E9.5 a densidad clonal, este método se puede utilizar para generar ratones mosaico que albergan miles de clones noqueantes genéticos discretos. A continuación, la secuenciación de próxima generación se puede utilizar para analizar el efecto de la ablación genética mediada por CRISPR/Cas9 dentro de esos clones de forma multiplexada^5.

Recientemente utilizamos este método para evaluar la función de 484 genes que muestran mutaciones recurrentes en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humano (HNSCC)⁵. El HNSCC es un cáncer devastador con una alta tasa de mortalidad del 40-50% y es el^6º cáncer más común en todo el mundo^6. El HNSCC surge en revestimientos mucosos de las vías respiratorias superiores o cavidad oral y se asocian con el consumo de tabaco y alcohol o la infección por el virus del papiloma humano (VPH). Carcinoma de células escamosas cutáneas (SCC) son tumores de piel y representan el segundo cáncer más común en los seres humanos^7. Cutánea SCC y HNSCC son histológica y molecularmente muy similares, con un alto porcentaje de casos que exhiben alteración en TP53, PIK3CA, NOTCH1 y HRAS^8. Si bien sólo hay un puñado de genes mutados a alta frecuencia, hay cientos de genes que se encuentran mutados a baja frecuencia (< 5%), un fenómeno comúnmente conocido como la distribución de cola larga. Como la mayoría de los genes de cola larga carecen de validación biológica o clínica, utilizamos esta tecnología de detección CRISPR in vivo para modelar la pérdida de la función de estos genes en ratones propensos a tumores con mutaciones sensibilizantes en p53, Pik3ca o Hras e identificamos varios genes supresores tumorales novedosos que cooperan con p53, Pik3ca o Hras para desencadenar el desarrollo tumoral^5.

Aquí, describimos un protocolo detallado para generar bibliotecas de sgRNA lentiviral CRISPR lentiviral multiplexed y realizar pantallas noqueadas del gen CRISPR/Cas9 en el ectodermo de la superficie del ratón. Cabe destacar que esta metodología se puede adaptar para incorporar otras tecnologías de manipulación genética como la activación CRISPR (CRISPRa) y la inactivación CRISPR (CRISPRi) o modificarse para dirigirse a otros sistemas de órganos del ratón para estudiar las funciones genéticas.