في فحص Vivo CRISPR/Cas9 لتقييم وظيفة الجينات في وقت واحد في جلد الماوس وتجويف الفم
Summary
هنا نصف منهجية فحص سريعة ومباشرة في vivo CRISPR/Cas9 باستخدام الحقن العدسية الجنينية الموجهة بالموجات فوق الصوتية لتقييم وظائف العديد من الجينات في الجلد وتجويف الفم للفئران ذات القدرة المناعية في وقت واحد.
Abstract
وقد لعبت نماذج الماوس المعدلة وراثيا دورا أساسيا في تقييم وظيفة الجينات، ونمذجة الأمراض البشرية، والعمل كنموذج قبل السريرية لتقييم السبل العلاجية. ومع ذلك ، فإن طبيعتها كثيفة الوقت والعمالة والتكلفة تحد من فائدتها للتحليل المنهجي لوظيفة الجينات. وتتغلب التطورات الأخيرة في تكنولوجيات تحرير الجينوم على هذه القيود وتسمح بالجيل السريع من الاضطرابات الجينية المحددة مباشرة داخل أجهزة فأرة محددة بطريقة متعددة السرعة. هنا ، نصف طريقة CRISPR / Cas9 المستندة إلى (تكرارات Palindromic القصيرة المتشابكة بانتظام) لتوليد الآلاف من استنساخ الجينات خارج داخل ظهارة الجلد وتجويف الفئران عن طريق الفم ، وتقديم بروتوكول يفصل الخطوات اللازمة لإجراء فحص مباشر في vivo CRISPR لجينات مثبط الورم. يمكن تطبيق هذا النهج على أجهزة أخرى أو تقنيات CRISPR/Cas9 الأخرى مثل تنشيط CRISPR أو تعطيل CRISPR لدراسة الوظيفة البيولوجية للجينات أثناء التوازن النسيجي أو في بيئات المرض المختلفة.
Introduction
أحد التحديات التي تواجه أبحاث السرطان في حقبة ما بعد الجينوم هو استخراج الكمية الهائلة من بيانات الجينوم للطفرات الجينية السببية وتحديد العقد في شبكة الجينات التي يمكن استهدافها علاجيا. وفي حين ساعدت التحليلات المعلوماتية الحيوية كثيرا على تحقيق هذه الأهداف، فإن إنشاء نماذج فعالة في المختبر وفي الجسم الحي شرط أساسي لفك شفرة تعقيد النظم البيولوجية وحالات الأمراض وتمكين تطوير الأدوية. في حين تم استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا التقليدية على نطاق واسع في دراسات علم الوراثة سرطان الجسم الحي، وطبيعتها التكلفة والوقت والعمالة الكثيفة حظرت إلى حد كبير التحليل المنهجي لمئات من جينات السرطان المفترضة التي كشفها الجينوم الحديث. للتغلب على هذا الاختناق، قمنا بالجمع بين منهجية حقن الموجات فوق الصوتية1،2 مع CRISPR/Cas9 (متفاوتة بانتظام قصيرة Palindromic يكرر) تكنولوجيا تحرير الجينات3 للحث في وقت واحد ودراسة فقدان وظيفة الطفرات من مئات الجينات في الجلد وتجويف الفم من فأر واحد.
تستخدم المنهجية الموصوفة هنا الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية للفيروسات العدسية المهندسة في تجويف السلى من أجنة الفئران الحية في اليوم الجنيني E9.5. تنقل الشحنة العدسية التي تحتوي على مكونات CRISPR/Cas9 ectoderm السطحي أحادي الطبقات ، والذي يؤدي لاحقا إلى ظهارة الجلد وتجويف الفم. يتكون الجلد من البشرة الخارجية، يليه غشاء الطابق السفلي والأدمة. البشرة هي ظهارة طبقية تتكون من طبقة داخلية وباسية ، تحافظ على ملامسة غشاء الطابق السفلي ولها قدرة على التكاثر والخلايا الجذعية. الطبقة القاعدية يؤدي إلى طبقات متمايزة أعلاه مثل طبقات القرنية الشوكية والحبيبية وطبقات الطبقة2،4. تظهر دراسات تتبع النسب أن هذه الطريقة المباشرة في vivo CRISPR/Cas9 تتلاعب وراثيا بالخلايا الجذعية المقيمة في الأنسجة داخل الطبقة القاعدية التي تستمر طوال مرحلة البلوغ. كما يمكن titrated lentivirus إلى تحويل ectoderm سطح E9.5 في كثافة كلونال، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الفئران الفسيفساء التي تؤوي الآلاف من الجينات المنفصلة خروج المغلوب استنساخ. ويمكن بعد ذلك الجيل التالي من التسلسل يمكن استخدامها لتحليل تأثير CRISPR / Cas9 بوساطة الاستئصال الجيني داخل تلك المستنسخات بطريقة متعددة5.
استخدمنا مؤخرا هذه الطريقة لتقييم وظيفة 484 الجينات التي تظهر الطفرات المتكررة في سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة البشرية (HNSCC)5. HNSCC هو سرطان مدمر مع ارتفاع معدل الوفيات من 40-50٪ وهو السرطان6 الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم6. ينشأ HNSCC في بطانات المخاطية في مجرى الهواء العلوي أو تجويف الفم وترتبط باستهلاك التبغ والكحول أو عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV). سرطان الخلايا الحرشفية الجلدية (SCC) هي أورام الجلد وتمثل ثاني أكثر أنواع السرطان شيوعا في البشر7. SCC الجلدية وHNSCC هي هي هي نفسها من الناحية النسيجية والجزيئية جدا، مع نسبة عالية من الحالات التي تظهر التغيير في TP53، PIK3CA، NOTCH1، وHRAS8. في حين لا يوجد سوى عدد قليل من الجينات تحور على تردد عال، وهناك مئات الجينات وجدت تحور في التردد المنخفض (< 5٪)، وهي ظاهرة يشار إليها عادة باسم التوزيع ذيل طويل. وبما أن غالبية الجينات ذات الذيل الطويل تفتقر إلى التحقق البيولوجي أو السريري ، استخدمنا هذا في تقنية فحص VIVO CRISPR لنمذجة فقدان وظيفة هذه الجينات في الفئران المعرضة للورم مع طفرات حساسة في p53 أو Pik3ca أو Hras وحددنا العديد من جينات مثبط الورم الجديدة التي تتعاون مع p53 أو Pik3ca أو Hras لتحريك تطور الورم5.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتوليد متعددة الأضلاع sgRNA lentiviral CRISPR مكتبات SgRNA وأداء CRISPR / Cas9 الجينات خروج المغلوب شاشات في ectoderm سطح الماوس. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تكييف هذه المنهجية لدمج تقنيات التلاعب الجيني الأخرى مثل تنشيط CRISPR (CRISPRa) و CRISPR تعطيل (CRISPRi) أو تعديلها لاستهداف أنظمة الأعضاء الأخرى في الماوس لدراسة الوظائف الجينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 على نطاق واسع في المختبر وفي الدراسات الحية للتحقيق في وظائف الجينات والعمليات الخلوية. معظم الدراسات في الجسم الحي الاستفادة كريسبر / Cas9 الجينات تحرير الخلايا المطعمة في نموذج حيواني (allograft أو xenograft). في حين أن هذا هو أداة قوية لدراسة علم الوراثة السرطان …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منحة مشروع من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR 365252) ومؤسسة كريمبيل وجولة التميز البحثي لصندوق أونتاريو للبحوث الجولة 8 (RE08-065). سامباث كومار لوغاناثان هو الحاصل على زمالة الجمعية الكندية للسرطان (BC-F-16#31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
