Структурные исследования биокромолекул с помощью кристаллографии требуют высококачественных кристаллов. Здесь мы демонстрируем протокол, который может быть использован OptiCrys (полностью автоматизированный инструмент, разработанный в нашей лаборатории) и / или microdialysis кнопки для выращивания больших высококачественных кристаллов на основе знаний о кристаллизации фазы диаграммы.
Использование нейтронной макромолекулярной кристаллографии (NMX) быстро расширяется, при этом большинство структур определяется в последнее десятилетие благодаря построению новых лучей NMX и повышению доступности программного обеспечения для уточнения структуры. Однако нейтронные источники, доступные в настоящее время для NMX, значительно слабее эквивалентных источников рентгеновской кристаллографии. Несмотря на достижения в этой области, для исследований нейтронной дифракции всегда потребуются значительно более крупные кристаллы, особенно с тенденцией к изучению все более крупных макромолекул и комплексов. Поэтому для расширения NMX необходимы дальнейшие усовершенствования методов и приборов, пригодных для выращивания более крупных кристаллов.
В этой работе мы вводим рациональные стратегии и скамейку роста кристаллов (OptiCrys), разработанную в нашей лаборатории, которая сочетает в себе наблюдение в режиме реального времени с помощью установленной микроскопом видеокамеры с точным автоматизированным управлением решениями кристаллизации (например, стремительной концентрацией, рН, добавкой, температурой). Затем мы демонстрируем, как этот контроль температуры и химического состава облегчает поиск оптимальных условий кристаллизации с использованием модельных растворимых белков. Тщательное знание диаграммы фазы кристаллизации имеет решающее значение для выбора исходного положения и кинетического пути для любого эксперимента кристаллизации. Мы показываем, как рациональный подход может контролировать размер и количество кристаллов, генерируемых на основе знаний многомерных фазовые диаграммы.
Понимание структуро-функциональных отношений белков и механизма физиологических путей часто зависит от знания позиций атомов водорода (H) и как заряд передается в пределахбелка 1,2. Так как атомы водорода рассеивают рентгеновские лучи слабо, их положение может быть определено только с очень высоким разрешением рентгеновских данных дифракции (Nogt;1)3,4. И наоборот, нейтронная кристаллография может быть использована для получения точного положения атомов водорода в биологических макромолекулах, так какатомы водорода и дейтерия(H 2, изотоп водорода) имеют разброс длин примерно одинаковой величины, как кислород, азот иуглерод 5. Тем не менее, нейтронный поток из имеющихся нейтронных источников слабее, чем у рентгеновских лучей, так что это часто должно бытькомпенсировано за 2,3. Этого можно достичь путем обмена H с H2 и/или увеличения объема кристаллов для уменьшения бессвязного рассеяния водородов и увеличения соотношения сигнала к шуму дифракционных изображений.
Существуют различные подходы к кристаллизации (соответствующая схематическая схема фазовая диаграмма показана на рисунке 1) для получения больших и высококачественных кристаллов как для рентгеновской, так и для нейтронной био-макромолекулярной кристаллографии6. При диффузии пара капля, приготовленная из смеси белка и раствора кристаллизации, со временем равноувеличилась через испарение воды или других летучих видов против резервуара, содержащего более высокую концентрацию осадков того же раствора кристаллизации. Увеличение концентрации белка и осадки в капле приводит к супернасыщению, необходимому для спонтанного нуклеации с последующим ростом кристалла вэтих ядрах 6,7. Хотя диффузия пара является наиболее часто используемым методомдля выращивания кристаллов 4,процесс кристаллизации не может быть точно контролируется8. В методе диффузии свободного интерфейса раствор кристаллизации рассеивается в концентрированном белковом растворе, очень медленно направляя систему на супернасыщение. Этот метод можно рассматривать как пакетный метод с медленной скоростьюсмешивания 6,9,10,11,12. В пакетной методике белок быстро смешивается с раствором кристаллизации, что приводит к быстрой супернасыщению и, в свою очередь, равномерному нуклеациисо многими кристаллами 3,7. На этот метод приходится примерно треть всех структур, которые в настоящее время депонированы в Банке данных по белкам. Метод диализа также используется для выращивания высококачественных и хорошо диффрактных кристаллов белка. В методе диализа молекулы обрывистого диффузии из резервуара через полупроницаемую мембрану в отдельную камеру с белковым раствором. Кинетики эквилибрации зависит от различных факторов, таких как температура, размер мембраны поры, а также объем и концентрация образцов белка и кристаллизацииагентов 6.
Диаграммы фазы кристаллизации могут быть использованы для описания различных состояний белка как функции различных физических или химических переменных3. Как показано на рисунке 1, каждый метод кристаллизации может быть визуализирован как использование другой кинетической траектории для достижения нуклеации и метастабибловыхзон такой диаграммы 6,10,13. Это дает информацию о растворимости белка и концентрации белка, при которой наблюдается термодинамическое равновесие между кристаллом и раствором, тем самым находя оптимальные условия длянуклеации и роста 3,14. На двухмерной фазовой диаграмме концентрация белка построена как функция одной переменной, а другие переменные остаются постоянными15. На такой фазовой диаграмме, когда концентрация белка ниже кривой растворимости, раствор находится в недонасыщенной области и не происходит нуклеации или роста кристалла. Над этой кривой находится зона супернасыщения, где концентрация белка выше, чем предел солуства3,14. Это далее делится на три области: метастабийная зона, зона самопроизвольного ядра и зона осадков. В метастабилярной зоне, супернасыщение не является достаточным для нуклеации произойти в течение разумного времени, но рост семенных кристаллов может иметь место. Агрегация и осадки благоприятствуют в зоне осадков, где супернасыщениеслишком высока 14,15.
Когда будет достигнуто достаточное количество супернасыщения для спонтанного нуклеации, первые ядра появятся10. Рост кристаллов приводит к снижению концентрации белка до тех пор, пока не будет достигнут предел растворимости. До тех пор, пока супернасыщение остается в непосредственной близости от кривой растворимости, не будет никаких существенных изменений в размерах кристаллов. Однако было показано, что колебания температуры и химического состава раствора кристаллизации (например, концентрация осадков) повлияют на раствор белка и могут привести к началу дальнейшегороста кристалла 8,13,16.
Поскольку диализ выгоден для роста кристаллов хорошего качества, скамейка кристаллизации OptiCrys, иллюстрированная на рисунке 2,была разработана и разработана в нашей лаборатории для управления кристаллизацией полностью автоматизированнойманерой 8. Для этого было написано программное обеспечение с LabVIEW, которое позволяет контролировать и контролировать температуру установки диализа резервуара в контакте с элементами Peltier, с помощью электронного контроллера и охладителя. Это же программное обеспечение также автоматически регулирует химический состав раствора кристаллизации (например, обмен кристаллическими агентами) с помощью многоканальной жидкостной системы. Кроме того, цифровая камера и перевернутый микроскоп используются для визуализации и записи процесса кристаллизации. Для выращивания кристаллов для различных целей доступны две камеры кристаллизации с объемами 15 МКл и 250 МКЛ. Поскольку процесс кристаллизации обратим, скрининг на различные условия возможен с помощью всего лишь нескольких микролитров белкового раствора до тех пор, пока образец неповрежден 8. В результате, используя этот метод сводит к минимуму количество используемого белкового материала.
Из предыдущейработы 8, очевидно, что во время процесса роста кристалла, на месте наблюдения должны проводиться через регулярные промежутки времени. Они могут варьироваться от нескольких секунд до нескольких дней, в зависимости от события под наблюдением (осадки, нуклеация, или рост кристалла).
Оптимизация роста кристаллов с помощью OptiCrys основана на диаграммах фазы температурной фазы. В случае белков с растворимости в качестве прямой функции температуры, можно использовать режим засолки из18. Именно здесь увеличение ионной прочности раствора, который можно визуализировать с помощью белково-обрывистых фазовых диаграмм, снижает растворимость белка. Аналогичным образом, белки с обратной растворимости может использовать соляной в режиме18. Нуклеация происходит в зоне нуклеации, в непосредственной близости от метастабиальной зоны, и рост кристалла происходит в метастабиальной зоне фазовой диаграммы до тех пор, пока концентрация белка не достигнет предела солублиции. Как показано на рисунке 3A, с постоянной температурой химического состава может быть уменьшена, чтобы сохранить кристаллизационный раствор в метастабиальной зоне, чтобы предотвратить новое нуклеацию. Кристаллы растут до тех пор, пока не будет достигнуто второе равновесие кристалла/раствора, и после этого дальнейшего увеличения размера кристаллов не наблюдается. Температура снижается в несколько раз, пока кристаллы не достигнут желаемого размера. На рисунке 3B,при постоянной температуре, повышение концентрации осадков сохраняет раствор в метастабильной зоне. Этот процесс может быть повторен несколько раз, чтобы получить большие кристаллы. Изменение температуры и манипулирование условиями решения кристаллизации, путем управления уровнями супернасыщения, являются двумя мощными инструментами для разделения нуклеации и роста кристаллов, которые контролируются точно и автоматически OptiCrys5,8,14.
Примеры кристаллов протеина, выращенных с помощью контролируемой температурой, или контролируемой температурой и высокой концентрацией кристаллизации, а также полученных данных относительной дифракции доступны в литературе и PDB. Среди них человеческий γ-кристаллин E, PA-IIL лектин, дрожжевые неорганические пирофосфазы, оксидазы уратов, углеродная ангидраза II человека, киназы ИчБ и лактатдегидрогеназы 5,14,17,18.
Хотя OptiCrys был коммерциализирован NatX-ray, есть много лабораторий, которые не имеют доступа к этому инструменту или серийному подходу, который он предлагает. Альтернативой этому методу является использование коммерчески доступных пластиковых кнопок микродиализа с различными объемами. Используя их, температурный и химический состав можно регулировать и менять вручную. Проверка кнопок микродиализа не может быть выполнена на месте и вместо этого должна быть сделана вручную с помощью оптического микроскопа. Контроль температуры может быть достигнут путем хранения образца в инкубаторе, свободном от вибрации, контролируемом температурой. Важно поддерживать постоянную температуру, чтобы эксперименты по кристаллизации были воспроизводимыми. Значительное изменение температуры может также привести к повреждению или разрушению кристаллов5.
Здесь мы предоставляем подробный протокол, описывающий подготовку образца и использование программного обеспечения для управления для роста больших, высококачественных кристаллов, пригодных для кристаллографии нейтронного белка. Эта пошаговая процедура была разработана, чтобы воспользоваться схемой фазы кристаллизации, чтобы выбрать исходное положение и кинетический путь для контроля размера и качества генерируемых кристаллов. Кроме того, представлен подробный протокол выращивания кристаллов с кнопками микродиализа, который использует то же обоснование для получения больших, высококачественных кристаллов.
Различные физические, химические и биологические переменные влияют на кристаллизацию белка, влияя на солукостьбелка 21. Среди этих переменных, температура и химический состав раствора кристаллизации используются здесь в сочетании с методом диализа для улучшения и выращивания больших высококачественных кристаллов биокромолекул для исследований нейтронной дифракции. Используя знания фазовых диаграмм, кристаллизация делается более предсказуемой. Хотя скрининг различных условий кристаллизации в серийном подходе также возможен, основная цель использования рациональных подходов заключается в разделении и контроле кинетики кристаллического ядра и роста.
Как и во всех исследованиях кристаллизации, высококачественные чистые и однородные образцы белка, а также решения кристаллизации без пыли увеличивают успешность эксперимента. Фильтрация и центрифугация решений являются важными шагами в описанных протоколах. Зная физикохимические свойства изученных белков, таких как молекулярный вес (выбрать соответствующую мембрану диализа), изоэлектрический момент, и белок solubility имеют решающее значение для разработки оптимального эксперимента роста кристалла. Кроме того, необходимо учитывать стабильность белка при различных температурах или с различными химическими веществами, чтобы предотвратить потерю образца и увеличить вероятность успеха. Учитывая температурный диапазон OptiCrys (233.0-353.0 ± 0.1 K), широкий спектр белков может быть кристаллизован с его помощью. Но стоит подчеркнуть, что белки, которые в первую очередь термостабличный, такие как белки из термофильных источников, выиграют больше всего в контролируемых температурой больших объемов кристаллических экспериментов роста, предлагаемых этим инструментом.
Используя малооъемную диализную камеру (при использовании кнопок OptiCrys) или микродиализа и скрининг нескольких температур и условий кристаллизации (например, сетки резкой концентрации или рН), можно получить информацию о расположении предела метастабиальной зоны (кинетическое равновесие между нуклеацией и метастабильными зонами). Это имеет неоценимое значение при разработке успешного эксперимента по росту кристаллов, особенно для новых кандидатов белка в кристаллизации. Без этой информации эксперименты могут начинаться с области фазовой диаграммы с высокой супернасыщением, слишком далеко от предела метастабиальной зоны, чтобы легко контролировать кристаллическое ядро. Хотя растворение осадка протеина может быть предпринято, например путем увеличивать температуру в случае сразу растворимости, для протеинов с уменьшенной термостабельностью, держать образец на высокой температуре на более длинний период времени может сделать высыпание протеина необратимым. Таким образом, лучшая стратегия состоит в использовании первоначального состояния с более низкой супернасыщенностью, расположенной вблизи предела метеоприбывания, где нуклеацию можно контролировать и избежать выпадения белков. В соответствии с этим, кристаллизация предварительной проверки снижает вероятность того, что белок осаждается в диализной камере и увеличивает скорость успеха эксперимента.
После разработки эксперимента, подготовка диализных камер (OptiCrys) или кнопок микродиализа является еще одним важным шагом. Предотвращение образования пузырьков воздуха в диализной камере/кнопке повышает вероятность успешной кристаллизации, особенно при использовании небольших объемов. Присутствие пузырьков воздуха в диализной камере может также изменить кинетику процесса кристаллизации и уменьшить воспроизводимость эксперимента (потому что контактная поверхность белка/раствора была изменена). На успех эксперимента может повлиять не только белок, но и раствор кристаллизации. Использование новых трубок 50 мл для насосной системы каждый раз, когда один хочет начать новый эксперимент и мытье труб после каждого эксперимента снижает вероятность загрязнения и позволяет избежать создания кристаллов соли в аппарате.
Использование кнопок микродиализа является альтернативой, когда OptiCrys недоступен. Стратегии оптимизации кристаллизации и мониторинга роста кристаллов, упомянутые выше, должны осуществляться вручную. Как правило, это требует назрения за пределами терморегулируемого инкубатора, что может быть проблематичным, когда регулирование температуры является критическим шагом в описанной методологии. Это не облегчает изменение химического состава растворов кристаллизации или мониторинг роста кристаллов с помощью изображений, поэтому процесс роста кристалла не может контролироваться в режиме реального времени.
Знание фазовой диаграммы является основой использования скамейки кристаллизации OptiCrys для систематического выращивания крупных высококачественных кристаллов в автоматическом режиме. Контроль физико-химических параметров, таких как температура, концентрация осадков и рН во время кристаллизации, перемещает равновесие белкового раствора по четко определенной кинетической траектории по фазовой диаграмме. Это дополняется использованием диализной мембраны для регулировки общественного транспорта и создания контролируемого градиента в камере кристаллизации, который влияет на размер и качество кристаллов. Поэтому использование как термодинамических данных, так и кинетических траекторий необходимо для контроля процесса кристаллизации для выращивания высококачественных кристаллов. Благодаря OptiCrys систематические фазовые диаграммы в многомерном пространстве можно изучать с помощью последовательного подхода, используя значительно меньше материала, чем раньше. Чтобы продемонстрировать эту методологию, мы предоставляем здесь пример с моделью белка, куриное яйцо-белый лизозим. Используя и осваивая представленный здесь протокол, можно адаптировать его к реальнымбелковым системам 5,14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
MBS признает поддержку LABEX VALO GRAL по контракту 2015 года. NJ признает CEA Международная докторская исследовательская программа (Irtelis) для phD стипендий. Авторы признают финансирование программы исследований и инноваций «Горизонт 2020» Европейского союза в рамках грантового соглашения Мари Склодовской-Кюри No 722687. Авторы также благодарны д-ру Эско Оксанену (ESS, Lund) и д-ру Джин-Люку Ферреру (IBS, Grenoble) за полезные беседы и идеи. IBS признает интеграцию в Междисциплинарный научно-исследовательский институт Гренобля (IRIG, CEA).
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |