Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.
El uso de cristalografía macromolecular de neutrones (NMX) se está expandiendo rápidamente con la mayoría de las estructuras determinadas en la última década gracias a la construcción de nuevas líneas de haz NMX y a una mayor disponibilidad de software de refinamiento de estructuras. Sin embargo, las fuentes de neutrones disponibles actualmente para NMX son significativamente más débiles que las fuentes equivalentes para la cristalografía de rayos X. A pesar de los avances en este campo, siempre serán necesarios cristales significativamente más grandes para los estudios de difracción de neutrones, particularmente con la tendencia a estudiar macromoléculas y complejos cada vez más grandes. Por lo tanto, son necesarias nuevas mejoras en los métodos y la instrumentación adecuados para el crecimiento de cristales más grandes para que el uso de NMX se expanda.
En este trabajo, introducimos estrategias racionales y un banco de crecimiento de cristal (OptiCrys) desarrollado en nuestro laboratorio que combina la observación en tiempo real a través de una cámara de vídeo montada en microscopio con un control automatizado preciso de las soluciones de cristalización (por ejemplo, concentración precipitante, pH, aditivo, temperatura). A continuación, demostramos cómo este control de la temperatura y la composición química facilita la búsqueda de condiciones óptimas de cristalización utilizando proteínas solubles modelo. El conocimiento exhaustivo del diagrama de fase de cristalización es crucial para seleccionar la posición inicial y la ruta cinética para cualquier experimento de cristalización. Mostramos cómo un enfoque racional puede controlar el tamaño y el número de cristales generados en función del conocimiento de diagramas de fase multidimensionales.
Comprender la relación estructura-función de las proteínas y el mecanismo de las vías fisiológicas a menudo se basa en conocer las posiciones de los átomos de hidrógeno (H) y cómo se transfiere la carga dentro de una proteína1,2. Dado que los átomos de hidrógeno dispersan los rayos X débilmente, sus posiciones sólo se pueden determinar con datos de difracción de rayos X de muy alta resolución (>1 Å)3,4. Por el contrario, la cristalografía de neutrones se puede utilizar para obtener una posición precisa de átomos de hidrógeno en macromoléculas biológicas como hidrógeno y átomos de deuterio (H2,isótopo de hidrógeno) tienen longitudes de dispersión de aproximadamente la misma magnitud que el oxígeno, nitrógeno y carbono5. Sin embargo, el flujo de neutrones de las fuentes de neutrones disponibles es más débil que el de los haces de rayos X, por lo que a menudo debe compensarse con2,3. Esto se puede lograr intercambiando H con H2 y/o aumentando el volumen de cristales para reducir la dispersión incoherente de los hidrógenos y aumentar la relación señal-ruido de las imágenes de difracción.
Hay varios enfoques de cristalización (el diagrama de fase esquemática correspondiente se muestra en la Figura 1)para obtener cristales grandes y de alta calidad para la cristalografía bio-macromolecular de rayos X y neutrones6. En la difusión de vapor, una gota preparada a partir de una mezcla de una proteína y una solución de cristalización se equilibra con el tiempo, a través de la evaporación del agua u otras especies volátiles, contra un reservorio que contiene una mayor concentración de precipitante de la misma solución de cristalización. El aumento de la concentración de proteínas y precipitantes en la gota conduce a la sobresaturación necesaria para la nucleación espontánea seguida del crecimiento cristalino en estos núcleos6,7. Aunque la difusión de vapor es la técnica más utilizada para el cultivo de cristales4,el proceso de cristalización no se puede controlar con precisión8. En el método de difusión de interfaz libre, la solución de cristalización se difunde en una solución de proteína concentrada, dirigiendo muy lentamente el sistema hacia la sobresaturación. Este método se puede considerar como un método de lote con una velocidad de mezcla lenta6,9,10,11,12. En el método por lotes, la proteína se mezcla rápidamente con una solución de cristalización que conduce a una supersaturación rápida y a su vez nucleación uniforme con muchos cristales3,7. Este método representa aproximadamente un tercio de todas las estructuras actualmente depositadas en el Banco de Datos de Proteínas. El método de diálisis también se utiliza para el cultivo de cristales proteicos de alta calidad y bien diffracting. En el método de diálisis, las moléculas de difusa precipitante de un reservorio a través de una membrana semi-permeable en una cámara separada con la solución proteica. La cinética del equilibrio depende de varios factores, como la temperatura, el tamaño del poro de membrana y el volumen y concentración de muestras de proteínas y agentes de cristalización6.
Los diagramas de fase de cristalización se pueden utilizar para describir diferentes estados de una proteína en función de diferentes variables físicas o químicas3. Como se ilustra en la Figura 1,cada técnica de cristalización se puede visualizar como el uso de una trayectoria cinética diferente para llegar a las zonas de nucleación y metástasis de tal diagrama6,10,13. Esto proporciona información sobre la solubilidad proteica y la concentración de proteínas a la que se observa un equilibrio termodinámico entre el cristal y la solución, encontrando así las condiciones óptimas para la nucleación y el crecimiento3,14. En un diagrama de fase bidimensional, la concentración de proteínas se traza como una función de una variable y las otras variables se mantienen constantes15. En dicho diagrama de fase, cuando la concentración de proteínas está por debajo de la curva de solubilidad, la solución se encuentra en la región subsaturada y no se produce nucleación ni crecimiento de cristales. Por encima de esta curva se encuentra la zona de sobresaturación donde la concentración de proteínas es superior al límite de solubilidad3,14. Esto se divide además en tres regiones: la zona metástasis, la zona de nucleación espontánea y la zona de precipitación. En la zona metastásica, la sobresaturación no es suficiente para que la nucleación ocurra en un tiempo razonable, pero el crecimiento de los cristales de semillas puede tener lugar. La agregación y precipitación se favorecen en la zona de precipitación, donde la sobresaturación es demasiado alta14,15.
Cuando se logra una supersaturación suficiente para la nucleación espontánea, aparecerán los primeros núcleos10. El crecimiento de los cristales conduce a una reducción en la concentración de proteínas hasta que se alcanza el límite de solubilidad. Mientras la supersaturación permanezca en las proximidades de la curva de solubilidad, no habrá ningún cambio significativo en el tamaño de los cristales. Sin embargo, se ha demostrado que las variaciones en la temperatura y composición química de la solución de cristalización (por ejemplo, la concentración de precipitante) afectarán a la solubilidad proteica y pueden conducir al inicio de un mayor crecimiento de cristal8,13,16.
Como la diálisis es ventajosa para el crecimiento de cristales de buena calidad, el banco de cristalización OptiCrys ilustrado en la Figura 2, fue diseñado y desarrollado en nuestro laboratorio para controlar la cristalización de una manera totalmente automatizada8. Para ello, se escribió un software con LabVIEW que permite el control y seguimiento de la temperatura de una configuración de diálisis del depósito que fluye en contacto con los elementos Peltier, a través de un controlador electrónico y un enfriador. El mismo software también regula automáticamente la composición química de la solución de cristalización (por ejemplo, el intercambio de agentes de cristalización) utilizando un sistema fluido multicanal. Además, una cámara digital y un microscopio invertido se utilizan para visualizar y grabar el proceso de cristalización. Dos cámaras de cristalización con volúmenes de 15 μL y 250 μL están disponibles para el cultivo de cristales para diferentes propósitos. Como el proceso de cristalización es reversible, la detección de diferentes condiciones es posible con sólo unos pocos microlitros de la solución proteica siempre y cuando la muestra no se dañe8. Como resultado, el uso de este método minimiza la cantidad de material proteico utilizado.
Del trabajo anterior8,es evidente que durante el proceso de crecimiento del cristal, las observaciones in situ deben llevarse a cabo a intervalos de tiempo regulares. Estos pueden variar de unos segundos a varios días, dependiendo del evento en observación (precipitación, nucleación o crecimiento de cristal).
La optimización del crecimiento de cristales con OptiCrys se basa en diagramas de fase de concentración precipitantes a temperatura. En el caso de proteínas con solubilidad como función directa de la temperatura, es posible hacer uso del régimen de salazón18. Aquí es donde el aumento de la fuerza iónica de la solución, que se puede visualizar utilizando diagramas de fase precipitantes a proteínas, disminuye la solubilidad de la proteína. Asimismo, las proteínas con solubilidad inversa pueden hacer uso del régimen de salazón18. La nucleación se produce en la zona de nucleación, en las proximidades de la zona metástasis, y el crecimiento del cristal tiene lugar en la zona metástasis del diagrama de fase hasta que la concentración de proteínas alcanza el límite de solubilidad. Como se muestra en la Figura 3A, con temperatura de composición química constante se puede disminuir para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis para evitar nuevas nucleación. Los cristales crecen hasta que se logra el segundo equilibrio cristal/solución y después de eso, no se observa ningún aumento adicional en el tamaño de los cristales. La temperatura se reduce varias veces hasta que los cristales alcanzan el tamaño deseado. En la Figura 3B,a temperatura constante, el aumento de la concentración precipitante mantiene la solución en la zona metástasis. Este proceso se puede repetir varias veces para obtener cristales grandes. Cambiar la temperatura y manipular las condiciones de la solución de cristalización, mediante el control de los niveles de sobresaturación, son dos potentes herramientas para separar la nucleación y el crecimiento de cristales que son controlados precisa y automáticamente por OptiCrys5,8,14.
En la literatura y el PDB están disponibles ejemplos de cristalización controlada por temperatura, temperatura y concentración precipitada, así como datos relativos de difracción obtenidos. Entre ellos se encuentran la γ-cristalina humana E, la lectina PA-IIL, la pirofosfatasa inorgánica de levadura, la urate oxidasa, la anhidrasis carbónica humana II, la quinasa YchB y lactato deshidrogenasa5,14,17,18.
Aunque OptiCrys fue comercializado por NatX-ray, hay muchos laboratorios que no tienen acceso a este instrumento o al enfoque en serie que ofrece. La alternativa a esta técnica es utilizar botones de microdiálisis plástica disponibles comercialmente con varios volúmenes. Con estos, la temperatura y la composición química se pueden ajustar y variar manualmente. La inspección de los botones de microdiálisis no se puede realizar in situ y, en su lugar, debe realizarse manualmente con un microscopio óptico. El control de temperatura se puede lograr manteniendo la muestra en una incubadora de temperatura controlada sin vibraciones. Es esencial mantener la temperatura constante para garantizar que los experimentos de cristalización sean reproducibles. Variación significativa de la temperatura también puede conducir a daños o destrucción de cristales5.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación de muestras y el uso de software de control para el crecimiento de cristales grandes y de alta calidad adecuados para la cristalografía de proteínas de neutrones. Este procedimiento paso a paso fue diseñado para aprovechar el diagrama de fase de cristalización con el fin de seleccionar una posición inicial y una ruta cinética para controlar el tamaño y la calidad de los cristales generados. Además, se presenta un protocolo detallado para el cultivo de cristales con botones de microdiálisis que utiliza la misma razón para obtener cristales grandes y de alta calidad.
Diferentes variables físicas, químicas y biológicas influyen en la cristalización de proteínas al afectar la solubilidad proteica21. Entre estas variables, la temperatura y la composición química de la solución de cristalización se utilizan aquí en combinación con la técnica de diálisis para mejorar y cultivar grandes cristales de alta calidad de biomacromolecules para estudios de difracción de neutrones. Mediante el conocimiento de diagramas de fase, la cristalización se hace más predecible. Aunque el cribado de diferentes condiciones de cristalización en un enfoque en serie también es posible, el objetivo principal de utilizar los enfoques racionales presentados es separar y controlar la cinética de la nucleación de cristal y el crecimiento.
Al igual que todos los estudios de cristalización, las muestras de proteínas puras y homogéneas de alta calidad y las soluciones de cristalización sin polvo aumentan la tasa de éxito del experimento. La filtración y la centrifugación de las soluciones son pasos esenciales en los protocolos descritos. Conocer las propiedades fisicoquímicas de las proteínas estudiadas como el peso molecular (para elegir la membrana de diálisis adecuada), el punto isoeléctrico y la solubilidad proteica son cruciales para el diseño de un experimento óptimo de crecimiento de cristal. Además, se debe tener en cuenta la estabilidad de las proteínas a diferentes temperaturas o con diferentes productos químicos para prevenir la pérdida de la muestra y aumentar la probabilidad de éxito. Teniendo en cuenta el rango de temperatura de OptiCrys (233.0–353.0 ± 0.1 K), una amplia gama de proteínas se puede cristalizar con él. Pero vale la pena destacar que las proteínas que son principalmente termoestables, como las proteínas de fuentes termofílicas, serían las que más se benefician en los experimentos de crecimiento de cristal de gran volumen controlados por temperatura ofrecidos por este instrumento.
Utilizando una cámara de diálisis de bajo volumen (cuando se utilizan OptiCrys) o botones de microdiálisis y examinando varias temperaturas y condiciones de cristalización (por ejemplo, rejillas de concentración precipitada o pH), es posible obtener información sobre la ubicación del límite de la zona metástasis (equilibrio cinético entre nucleación y zonas metastásicas). Esto es invaluable al diseñar un experimento exitoso de crecimiento de cristales, especialmente para los nuevos candidatos a proteínas en cristalización. Sin esta información los experimentos pueden comenzar desde un área del diagrama de fase con alta supersaturación, demasiado lejos del límite de la zona metástasis para controlar fácilmente la nucleación cristalina. Aunque se puede intentar la disolución del precipitado proteico, por ejemplo aumentando la temperatura en caso de solubilidad directa, para proteínas con menor termosabilidad, mantener la muestra a alta temperatura durante un período de tiempo más largo puede hacer irreversible la precipitación proteica. Por lo tanto, la mejor estrategia consiste en utilizar una condición inicial con una sobresaturación más baja situada cerca del límite de metastabilidad, donde se puede controlar la nucleación y evitar la precipitación proteica. En línea con esto, la preselección de cristalización disminuye la probabilidad de tener un precipitado proteico en la cámara de diálisis y aumenta la tasa de éxito del experimento.
Después de diseñar un experimento, preparar cámaras de diálisis (OptiCrys) o botones de microdiálisis es otro paso importante. La prevención de la formación de burbujas de aire en la cámara/botón de diálisis aumenta la posibilidad de cristalización exitosa, especialmente cuando se utilizan pequeños volúmenes. La presencia de burbujas de aire en la cámara de diálisis también puede cambiar la cinética del proceso de cristalización y reducir la reproducibilidad del experimento (porque se ha modificado la superficie de contacto proteína/solución). No sólo la proteína, sino también la solución de cristalización pueden afectar el éxito del experimento. El uso de nuevos tubos de 50 ml para el sistema de bombeo cada vez que uno quiere iniciar un nuevo experimento y tubo de lavado después de cada experimento disminuye la posibilidad de contaminación y evita la creación de cristales de sal en el aparato.
El uso de botones de microdiálisis es una alternativa cuando OptiCrys no está disponible. Las estrategias para optimizar la cristalización y el seguimiento del crecimiento de cristal mencionados anteriormente, deben llevarse a cabo manualmente. Por lo general, esto requiere estar fuera de una incubadora termoregulada, lo que puede ser problemático cuando la regulación de la temperatura es un paso crítico en la metodología descrita. Esto no facilita el cambio de la composición química de las soluciones de cristalización, o el monitoreo del crecimiento del cristal por imágenes, por lo que el proceso de crecimiento del cristal no se puede controlar en tiempo real.
El conocimiento del diagrama de fase es la base del uso del banco de cristalización, OptiCrys, para cultivar sistemáticamente cristales grandes y de alta calidad de forma automatizada. El control de parámetros fisicoquímicos como la temperatura, la concentración precipitante y el pH durante la cristalización mueve el equilibrio proteína-solución en una trayectoria cinética bien definida a través del diagrama de fase. Esto se complementa con el uso de una membrana de diálisis para ajustar el transporte masivo y crear un gradiente controlado en la cámara de cristalización que afecta al tamaño y la calidad de los cristales. Por lo tanto, el uso de datos termodinámicos y trayectorias cinéticas es esencial para controlar el proceso de cristalización con el fin de cultivar cristales de alta calidad. Gracias a OptiCrys, los diagramas de fase sistemáticos en un espacio multidimensional se pueden estudiar con un enfoque en serie utilizando significativamente menos material que antes. Para demostrar esta metodología, proporcionamos aquí un caso de estudio con una proteína modelo, lisozyme de clara de huevo de pollo. Mediante el uso y masterización del protocolo presentado aquí se puede adaptar para sistemas proteicos reales5,14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
MBS reconoce el apoyo de LABEX VALO GRAL en virtud del contrato de 2015. NJ reconoce el Programa Internacional de Investigación doctoral (Irtelis) de la CEA para la Beca de Doctorado. Los autores reconocen la financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie número 722687. Los autores también están agradecidos al Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) y al Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) por sus conversaciones e ideas útiles. IBS reconoce su integración en el Instituto Interdisciplinario de Investigación de Grenoble (IRIG, CEA).
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |