結晶学による生体高分子の構造研究では、高品質の結晶が必要です。ここでは、結晶化相図の知識に基づいて、大規模な高品質の結晶を成長させるためのOptiCrys(当社の研究室で開発された完全に自動化された機器)および/またはマイクロ透析ボタンで使用できるプロトコルを示しています。
新しいNMXビームラインが構築され、構造改良ソフトウェアの可用性が向上したおかげで、過去10年間に決定されたほとんどの構造で、中性子高分子結晶学(NMX)の使用は急速に拡大しています。しかし、現在NMXで利用可能な中性子源は、X線結晶学の同等の源よりも著しく弱い。この分野の進歩にもかかわらず、特にこれまで以上に大きな高分子や複合体を研究する傾向があり、中性子回折研究には常に大幅に大きな結晶が必要です。したがって、NMXの使用を拡大するためには、より大きな結晶の成長に適した方法と計装のさらなる改善が必要です。
本研究では、顕微鏡搭載型ビデオカメラを用いたリアルタイム観察と、結晶化液(例えば、沈殿物濃度、pH、添加剤、温度)を組み合わせた合理的な戦略と結晶成長ベンチ(OptiCrys)を紹介します。次に、この温度と化学組成の制御が、モデル可溶性タンパク質を用いた最適な結晶化条件の探索を促進する方法を示す。結晶化の実験の開始位置と運動経路を選択するには、結晶化相図の十分な知識が不可欠です。多次元相図の知識に基づいて、合理的なアプローチが生成される結晶の大きさと数を制御する方法を示す。
タンパク質の構造機能関係と生理的経路のメカニズムを理解することは、しばしば水素原子(H)の位置とタンパク質1,2内で電荷がどのように伝達されているかを知ることに依存する。水素原子はX線を弱く散乱するので、その位置は非常に高分解能のX線回折データ(>1Å)3,4でしか決定できない。逆に、中性子結晶学は、水素と重水素(H2、水素の同位体)原子が酸素、窒素および炭素5とほぼ等しい大きさの散乱長を有するように生体高分子における水素原子の正確な位置を得るために使用することができる。しかし、利用可能な中性子源からの中性子磁束はX線ビームのそれよりも弱いので、これはしばしば2、3を補わなければならない。HとHを交換したり、結晶の体積を増やしたりして、水素の支離滅裂な散乱を減らし、回折画像の信号対雑音比を高めることで実現できます。
X線および中性子生体高分子結晶学6の両方に対して大きく、高品質の結晶を得るための様々な結晶化アプローチ(図1に対応する模式相図を示す)がある。蒸気拡散では、タンパク質と結晶化溶液の混合物から調製された液滴は、水または他の揮発性種の蒸発を通じて、同じ結晶化溶液のより高い濃度の沈殿物を含む貯蔵所に対して、時間の経過とともに平衡化される。液滴中のタンパク質および沈殿物の濃度の増加は、これらの核6,7での結晶成長に続いて、自発的核形成に必要な過飽和をもたらす。水蒸気拡散は結晶4を成長する最も頻繁に使用される技術であるが、結晶化プロセスは正確に制御することができない8.自由界面拡散法では、結晶化溶液は濃縮タンパク質溶液に拡散し、システムを過飽和に向けて非常にゆっくりと導く。この方法は、遅い混合率6、9、10、11、12のバッチ方式と考えることができます。バッチ法では、タンパク質は急速に過飽和に至る結晶化溶液と混合され、多くの結晶3,7と共に均一な核形成を行う。この方法は、現在タンパク質データバンクに預け入れされているすべての構造の約3分の1を占めています。透析法は、高品質でよく拡散性の高いタンパク質結晶を成長させることにも使用されます。透析法では、沈殿物の分子が、半透過性膜を通って、タンパク質溶液を用いて別のチャンバーに貯蔵室から拡散する。平衡の動態は、温度、膜孔サイズ、タンパク質サンプルおよび結晶化剤6の体積および濃度などの様々な要因に依存する。
結晶化相図は、タンパク質の異なる状態を異なる物理変数または化学変数3の関数として記述するために使用することができる。図1に示すように、各結晶化技術は、異なる運動軌道を用いて、このような図6、10、13の核形成および転移性ゾーンに到達するように可視化することができる。結晶と溶液の熱力学的平衡が観察されるタンパク質溶解度およびタンパク質濃度に関する情報を提供し、それによって核生成および成長に最適な条件を見つける3,14。2次元相図では、タンパク質濃度は一つの変数の関数としてプロットされ、他の変数は一定の15に保たれます。このような相図では、タンパク質濃度が溶解性曲線を下回ると、溶液が不飽和領域にあり、核生成や結晶成長が生じない。この曲線の上には、タンパク質濃度が溶解限界3,14よりも高い過飽和帯がある。これはさらに3つの領域に分かれています:転移性ゾーン、自然核生成ゾーン、および降水域。転移性領域では、重飽和は、核形成が妥当な時間内に起こるには十分ではないが、種化された結晶の成長が起こり得る。凝集と降水量は、過飽和が高すぎる降水域で好まれ、14,15です。
自発的な核形成に十分な過飽和が達成されると、最初の核は10に現れる。結晶の成長は、溶解性の限界に達するまでタンパク質濃度の低下をもたらす。超飽和が溶解曲線の近傍にとどまっている限り、結晶の大きさに大きな変化はありません。しかしながら、結晶化液の温度および化学組成の変動(例えば、沈殿剤の濃度)がタンパク質溶解性に影響を及ぼし、さらに結晶成長8、13、16の開始を招く可能性が示されている。
透析は良質の結晶成長に有利であるとして、 図2に示されているOptiCrys結晶化ベンチは、完全に自動化された方法で結晶化を制御するために我々の研究室で設計され、開発された8。この目的のために、ソフトウェアは、電子コントローラとチラーを介して、ペルチェの要素と接触して流れる貯水池透析のセットアップの温度の制御と監視を可能にするLabVIEWで書かれました。同じソフトウェアは、多流流体システムを使用して、結晶化溶液の化学組成(例えば結晶化剤の交換)を自動的に調節します。さらに、デジタルカメラと反転顕微鏡を使用して、結晶化プロセスを可視化して記録します。15 μLおよび250 μLの容積の2つの結晶化の部屋は異なった目的のために成長する水晶のために利用できる。結晶化プロセスが可逆的であるため、サンプルが損傷していない限り、タンパク質溶液のほんの数マイクロリットルで異なる条件のスクリーニングが可能である8。その結果、この方法を用い、使用されるタンパク質物質の量を最小限に抑える。
前の研究8から、結晶成長過程の間、 その現場で の観察は一定の時間間隔で行う必要があることが明らかである。これらは、観察中の事象(沈殿、核生成、または結晶成長)に応じて、数秒から数日の範囲で行うことができます。
OptiCrysによる結晶成長の最適化は、温度沈殿物濃度相図に基づいています。温度の直接機能として溶解度を有するタンパク質の場合には、塩漬けレジーム18を利用することができる。このことは、タンパク質沈殿相図を用いて可視化できる溶液のイオン強度を高めることで、タンパク質の溶解度を低下させる。同様に、溶解性が逆のタンパク質は、塩漬けのレジーム18を利用することができる。核生成は、核形成領域において、メタスタブルゾーンの近傍で起こり、そして結晶成長は、タンパク質濃度が溶解限界に達するまで、相図の転移性ゾーンにおいて起こる。図3Aに示すように、一定の化学組成温度を有するとともに、新たな核生成を防止するために、結晶化液をメタスタブルゾーンに保つために低下させることができる。結晶は第2結晶/溶液平衡が達成されるまで成長し、その後、結晶のサイズのそれ以上の増加は見られません。結晶が所望の大きさに達するまで、温度は数回低下します。図3Bでは、一定温度で、沈殿物濃度を上げると、溶液がメタスタブルゾーンに保たれます。このプロセスは、大きな結晶を得るために数回繰り返すことができます。温度を変え、結晶化液条件を操作し、過飽和レベルを制御することにより、OptiCrys5,8,14によって正確かつ自動的に制御される結晶の核化と成長を分離するための2つの強力なツールである。
温度制御によって成長したタンパク質結晶の例としては、温度制御された、あるいは温度および沈殿物濃度制御結晶化、並びに得られる相対回折データが文献およびPDBに利用可能である。その中には、ヒトγ-結晶E、PA-IILレクチン、酵母無機ピロホスファターゼ、ウレートオキシダーゼ、ヒト炭酸脱水酵素II、YchBキナーゼ、乳酸脱水素酵素5、14、17、18が含まれる。
OptiCrysはNatX線によって製品化されましたが、この機器やシリアルアプローチにアクセスできない研究所が数多くあります。この技術の代替は、市販のプラスチック製のマイクロ透析ボタンを様々な容積で使用することです。これらを使用して、温度および化学組成を手動で調節し、変えることができる。マイクロ透析ボタンの検査 は、その場合 は行うことができず、光学顕微鏡で手動で行う必要があります。温度制御は、振動のない温度制御インキュベーターにサンプルを保持することによって達成することができる。結晶化実験を再現するためには温度を一定に保つことが不可欠です。温度の著しい変動は、結晶5の損傷または破壊を招く可能性もある。
ここでは、中性子タンパク質結晶学に適した大きな高品質の結晶の成長のためのサンプル調製と制御ソフトウェアの使用を説明する詳細なプロトコルを提供します。このステップバイステップの手順は、生成される結晶のサイズと品質を制御するために開始位置と運動経路を選択するために結晶化相図を利用するように設計されました。さらに、大きくて高品質な結晶を得るために同じ根拠を使用するマイクロ透析ボタンを備えた結晶を成長させる詳細なプロトコルが提示される。
異なる物理的、化学的および生物学的変数は、タンパク質の溶解度21に影響を与えることによってタンパク質の結晶化に影響を与える。これらの変数の中でも、結晶化溶液の温度と化学組成は、中性子回折研究のために生体高分子の大きな高品質結晶を改善し、成長させるために透析技術と組み合わせて使用されています。位相図の知識を用いることで、結晶化がより予測可能になります。連続的アプローチで異なる結晶化条件のスクリーニングも可能であるが、提示された合理的なアプローチを使用する主な目的は、結晶核化および成長の運動学を分離し、制御することである。
すべての結晶化研究と同様に、高品質の純粋で均質なタンパク質サンプル、およびダストフリーの結晶化溶液は、実験の成功率を高めます。溶液の濾過および遠心分離は、記載されたプロトコルにおいて不可欠なステップである。分子量(適切な透析膜を選択する)、等電点、タンパク質溶解度など、研究したタンパク質の物理化学的性質を知ることは、最適な結晶成長実験の設計に不可欠です。また、サンプルロスを防止し、成功の可能性を高めるために、異なる温度または異なる化学物質でのタンパク質安定性を考慮する必要があります。OptiCrys (233.0 ~353.0 ± 0.1 K) の温度範囲を考慮すると、幅広いタンパク質を使用して結晶化することができます。しかし、熱性源のタンパク質など、主に熱安定性の高いタンパク質は、この装置が提供する温度制御された大量結晶成長実験で最も利益を得ることを強調する価値があります。
少量透析チャンバー(OptiCrysを使用する場合)またはミクロ透析ボタンを使用して、いくつかの温度および結晶化条件(例えば、沈殿物濃度またはpHのグリッド)をスクリーニングすることによって、転移ゾーン(核形成と転移帯の間の運動平衡)の限界の位置に関する情報を得ることは可能である。これは、特に結晶化の新しいタンパク質候補に対して成功した結晶成長実験を設計する際に非常に貴重です。この情報がなければ、高い過飽和の位相図の領域から、結晶核形成を容易に制御するには、メタスタブルゾーンの限界から遠すぎるところから実験を開始できる。タンパク質沈殿の溶解は、例えば直接溶解性の場合には温度を上昇させることによって、より低い熱安定性を有するタンパク質に対して、より長い期間高温で試料を保ち、タンパク質沈殿を不可逆的に引き起こす可能性がある。したがって、最良の戦略は、核生成を制御し、タンパク質沈殿を回避することができる転移性の限界近くに位置する低い過飽和を持つ初期条件を使用することから成り立っている。これに伴い、結晶化前スクリーニングは透析チャンバーにタンパク質沈殿物を有する可能性を減少させ、実験の成功率を増加させる。
実験を設計した後、透析室(OptiCrys)またはマイクロ透析ボタンを準備することも重要なステップです。透析チャンバー/ボタン内の気泡の形成を防ぐことは、特に少量が使用されている場合に結晶化が成功する可能性を高めます。透析チャンバ内の気泡の存在はまた、結晶化プロセスの運動を変更し、実験の再現性を低下させる可能性があります(タンパク質/溶液接触面が改変されているため)。タンパク質だけでなく、結晶化溶液も実験の成功に影響を与える可能性があります。ポンプシステムに新しい50 mLチューブを使用するたびに、新しい実験を開始し、各実験の後にチューブを洗浄すると、汚染の可能性が減少し、装置内の塩結晶の作成を回避します。
微小透析ボタンの使用は、OptiCrysが使用できない場合の代替手段です。上記の結晶成長を最適化し、結晶成長を監視するための戦略は、手動で行う必要があります。通常、これは、温度調節が記載された方法論の重要なステップである場合に問題になる可能性があり、熱調節インキュベーターの外に存在する必要があります。これは、結晶化液の化学組成の変化や、イメージングによる結晶成長のモニタリングを促進しないため、結晶成長プロセスをリアルタイムで制御することはできません。
位相図の知識は、結晶化ベンチOptiCrysを使用して、大規模で高品質の結晶を自動で体系的に成長させることの基礎です。結晶化時の温度、沈殿物濃度、pHなどの物理化学的パラメータの制御は、相図全体にわたって明確に定義された運動軌道におけるタンパク質溶液平衡を移動させる。これは、透析膜を使用して質量輸送を調整し、結晶の大きさと品質に影響を与える結晶化チャンバー内に制御された勾配を作成することによって補完されます。したがって、熱力学データと運動軌道の両方を使用することは、高品質の結晶を成長させるために結晶化プロセスを制御するために不可欠です。OptiCrysのおかげで、多次元空間における系統的な位相図は、以前よりかなり少ない材料を使用してシリアルアプローチで研究することができます。この方法論を実証するために、ここではモデルタンパク質である鶏卵白リソザイムを用いたケーススタディを提供します。ここで紹介するプロトコルを使用してマスタリングすることで、実際のタンパク質システム5、14、17、18に適応することができます。
The authors have nothing to disclose.
MBSは、契約2015の下でLABEX VALO GRALからのサポートを認めています。NJは、CEAの国際博士研究プログラム(イルテリス)の博士フェローシップを認めています。著者らは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金協定番号722687の下で、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムからの資金提供を認めている。著者はまた、Esko Oksanen博士(ESS、ルンド)とジャン=リュック・フェレール博士(IBS、グルノーブル)に有益な会話と洞察に感謝しています。IBSは、グルノーブル学際研究所(CEA)への統合を認めています。
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |