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Biology

Optimierung des Kristallwachstums für die Neutronenmakromolekulare Kristallographie

Published: March 13, 2021
doi:
10.3791/61685
, ,
1CEA, CNRS, IBS,Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

Strukturstudien von Biomakromolekülen durch Kristallographie erfordern hochwertige Kristalle. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys (ein vollautomatisiertes Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde) und/oder Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle verwendet werden kann, basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.

Abstract

Der Einsatz der Neutronenmakromolekularen Kristallographie (NMX) expandiert rasant, wobei die meisten Strukturen in den letzten zehn Jahren ermittelt wurden, dank der Entwicklung neuer NMX-Strahllinien und der erhöhten Verfügbarkeit von Software zur Strukturverfeinerung. Die derzeit für NMX verfügbaren Neutronenquellen sind jedoch deutlich schwächer als die äquivalenten Quellen für die Röntgenkristallographie. Trotz Der Fortschritte in diesem Bereich werden immer deutlich größere Kristalle für Neutronenbeugungsstudien benötigt, insbesondere bei der Tendenz, immer größere Makromoleküle und Komplexe zu untersuchen. Weitere Verbesserungen der Methoden und Instrumente für den Anbau größerer Kristalle sind daher notwendig, um den Einsatz von NMX zu erweitern.

In dieser Arbeit stellen wir rationale Strategien und eine in unserem Labor entwickelte Kristallwachstumsbank (OptiCrys) vor, die Echtzeitbeobachtung durch eine mikroskopisch montierte Videokamera mit einer präzisen automatisierten Steuerung von Kristallisationslösungen (z. B. Niederschlagskonzentration, pH-Wert, Additiv, Temperatur) kombiniert. Wir zeigen dann, wie diese Temperatur- und chemische Zusammensetzung die Suche nach optimalen Kristallisationsbedingungen mit modelllöslichen Proteinen erleichtert. Eine gründliche Kenntnis des Kristallisationsphasendiagramms ist entscheidend für die Auswahl der Ausgangsposition und des kinetischen Pfades für jedes Kristallisationsexperiment. Wir zeigen, wie ein rationaler Ansatz die Größe und Anzahl der erzeugten Kristalle steuern kann, basierend auf dem Wissen über mehrdimensionale Phasendiagramme.

Introduction

Das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Proteinen und des Mechanismus physiologischer Pfade beruht oft darauf, die Positionen von Wasserstoffatomen (H) zu kennen und zu wissen, wie die Ladung innerhalb eines Proteins1,2übertragen wird. Da Wasserstoffatome Röntgenstrahlen schwach streuen, können ihre Positionen nur mit sehr hochauflösenden Röntgenbeugungsdaten (>1)3,4bestimmt werden. Umgekehrt kann die Neutronenkristallographie verwendet werden, um eine genaue Position von Wasserstoffatomen in biologischen Makromolekülen zu erhalten, da Wasserstoff- und Deuteriumatome(H2, Isotop von Wasserstoff) Streulängen von ungefähr gleicher Größe wie Sauerstoff, Stickstoff und Kohlenstoff5haben. Der Neutronenfluss aus verfügbaren Neutronenquellen ist jedoch schwächer als der von Röntgenstrahlen, so dass dies oft für2,3kompensiert werden muss. Dies kann durch den Austausch von H mitH2 und/oder die Erhöhung des Kristallvolumens erreicht werden, um die inkohärente Streuung von Wasserstoffen zu reduzieren und das Signal-Rausch-Verhältnis von Beugungsbildern zu erhöhen.

Es gibt verschiedene Kristallisationsansätze (das entsprechende schematische Phasendiagramm ist in Abbildung 1dargestellt), um große und hochwertige Kristalle sowohl für die Röntgen- als auch für die Neutronen-Bio-Makromolekularkristallographie6zu erhalten. Bei der Dampfdiffusion wird ein Tröpfchen, das aus einer Mischung aus einem Protein und einer Kristallisationslösung hergestellt wird, im Laufe der Zeit durch Verdunstung von Wasser oder anderen flüchtigen Arten gegen ein Reservoir ausgeglichen, das eine höhere Konzentration des Niederschlags derselben Kristallisationslösung enthält. Die Erhöhung der Proteinkonzentration und des Niederschlags im Tröpfchen führt zu der Für-spontane Keimbildung erforderlichen Übersättigung, gefolgt von Kristallwachstum an diesen Kernen6,7. Obwohl die Dampfdiffusion die am häufigsten verwendete Technik für den Anbau von Kristallen4ist, kann der Kristallisationsprozess nicht präzise gesteuert werden8. Bei der freien Grenzflächendiffusionsmethode diffundiert die Kristallisationslösung in eine konzentrierte Proteinlösung und lenkt das System sehr langsam in Richtung Übersättigung. Diese Methode kann als Batch-Methode mit einer langsamen Mischrate6,9,10,11,12betrachtet werden. Bei der Chargenmethode wird das Protein schnell mit einer Kristallisationslösung vermischt, die zu einer schnellen Übersättigung und damit zu einer gleichmäßigen Keimbildung mit vielen Kristallen3,7führt. Diese Methode macht etwa ein Drittel aller Strukturen aus, die derzeit in der Protein Data Bank deponiert sind. Die Dialysemethode wird auch für den Anbau hochwertiger und gut diffrierender Proteinkristalle eingesetzt. Bei der Dialysemethode diffundieren Moleküle von Niederschlagsmitteln aus einem Reservoir durch eine halbdurchlässige Membran in eine separate Kammer mit der Proteinlösung. Die Kinetik des Gleichgewichts hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie Temperatur, Membranporengröße und Volumen und Konzentration von Proteinproben und Kristallisationsmitteln6.

Kristallisationsphasendiagramme können verwendet werden, um verschiedene Zustände eines Proteins als Funktion der verschiedenen physikalischen oder chemischen Variablen3zu beschreiben. Wie in Abbildung 1dargestellt, kann jede Kristallisationstechnik so visualisiert werden, dass sie eine andere kinetische Flugbahn verwendet, um die Kern- und metastabilen Zonen eines solchen Diagramms6,10,13zu erreichen. Dies liefert Informationen über die Proteinlöslichkeit und die Proteinkonzentration, bei der ein thermodynamisches Gleichgewicht zwischen Kristall und Lösung beobachtet wird, wodurch die optimalen Bedingungen für Keimbildung und Wachstum gefunden werden3,14. In einem zweidimensionalen Phasendiagramm wird die Proteinkonzentration als Funktion einer Variablen dargestellt und die anderen Variablen werden konstantgehalten 15. In einem solchen Phasendiagramm, wenn die Proteinkonzentration unterhalb der Löslichkeitskurve liegt, befindet sich die Lösung in der untergesättigten Region und es tritt kein Keimbildung oder Kristallwachstum auf. Oberhalb dieser Kurve befindet sich die Übersättigungszone, in der die Proteinkonzentration höher ist als die Löslichkeitsgrenze3,14. Dies wird weiter in drei Regionen unterteilt: die metastabile Zone, die spontane Keimungszone und die Niederschlagszone. In der metastabilen Zone reicht eine Übersättigung nicht aus, um innerhalb einer angemessenen Zeit eine Keimbildung zu ermöglichen, aber das Wachstum von Samenkristallen kann stattfinden. Aggregation und Niederschlag werden in der Niederschlagszone bevorzugt, wo die Übersättigung zu hoch ist14,15.

Wenn eine ausreichende Übersättigung für eine spontane Keimbildung erreicht ist, erscheinen die ersten Kerne10. Das Wachstum von Kristallen führt zu einer Verringerung der Proteinkonzentration, bis die Löslichkeitsgrenze erreicht ist. Solange die Übersättigung in der Nähe der Löslichkeitskurve bleibt, wird sich die Größe der Kristalle nicht wesentlich ändern. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Schwankungen der Temperatur und chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösung (z. B. die Konzentration des Niederschlags) die Proteinlöslichkeit beeinflussen und zur Einleitung eines weiterenKristallwachstums8,13,16führen können.

Da die Dialyse für ein hochwertiges Kristallwachstum von Vorteil ist, wurde die in Abbildung 2dargestellte OptiCrys Kristallisationsbank in unserem Labor entwickelt und entwickelt, um die Kristallisation vollautomatisch zu steuern8. Zu diesem Zweck wurde mit LabVIEW eine Software geschrieben, die die Steuerung und Überwachung der Temperatur einer fließenden Reservoir-Dialyse-Einrichtung in Kontakt mit Peltier-Elementen über eine elektronische Steuerung und einen Kühler ermöglicht. Dieselbe Software reguliert auch automatisch die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung (z.B. den Austausch von Kristallisationsmitteln) mit einem Mehrkanal-Fluidsystem. Zusätzlich werden eine Digitalkamera und ein invertiertes Mikroskop verwendet, um den Kristallisationsprozess zu visualisieren und aufzuzeichnen. Für den Anbau von Kristallen für unterschiedliche Zwecke stehen zwei Kristallisationskammern mit 15 L- und 250-L-Volumen zur Verfügung. Da der Kristallisationsprozess reversibel ist, ist ein Screening auf verschiedene Bedingungen mit nur wenigen Mikrolitern der Proteinlösung möglich, solange die Probe nicht beschädigt ist8. Daher minimiert die Verwendung dieser Methode die Menge des verwendeten Proteinmaterials.

Aus früheren Arbeiten8ist es offensichtlich, dass während des Kristallwachstumsprozesses in situ Beobachtungen in regelmäßigen Zeitabständen durchgeführt werden müssen. Diese können je nach Beobachtungsereignis (Niederschlag, Keimbildung oder Kristallwachstum) von wenigen Sekunden bis zu mehreren Tagen reichen.

Die Optimierung des Kristallwachstums mit OptiCrys basiert auf temperaturumfällten Konzentrationsphasendiagrammen. Bei Proteinen mit Löslichkeit als direkte Temperaturfunktion ist es möglich, das Aussalzungsregime18zu nutzen. Hier verringert die Erhöhung der Ionenstärke der Lösung, die mit protein-gefällten Phasendiagrammen visualisiert werden kann, die Löslichkeit des Proteins. Ebenso können Proteine mit inverser Löslichkeit das Einsalzungsregime18nutzen. Die Keimbildung findet in der Keimungszone, in der Nähe der metastabilen Zone statt, und das Kristallwachstum findet dann in der metastabilen Zone des Phasendiagramms statt, bis die Proteinkonzentration die Löslichkeitsgrenze erreicht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, kann bei konstanter chemischer Zusammensetzung die Temperatur verringert werden, um die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone zu halten, um eine neue Keimbildung zu verhindern. Kristalle wachsen, bis das zweite Kristall/Lösungsgleichgewicht erreicht ist und danach keine weitere Zunahme der Kristallgröße beobachtet wird. Die Temperatur wird mehrmals verringert, bis die Kristalle die gewünschte Größe erreichen. In Abbildung 3B, bei konstanter Temperatur, hält die Erhöhung der Niederschlagskonzentration die Lösung in der metastabilen Zone. Dieser Prozess kann dann mehrmals wiederholt werden, um große Kristalle zu erhalten. Die Änderung der Temperatur und die Manipulation der KristallisationslösungBedingungen, durch die Kontrolle der Übersättigungsniveaus, sind zwei leistungsstarke Werkzeuge für die Trennung von Keimbildung und Wachstum von Kristallen, die präzise und automatisch von OptiCrys5,8,14gesteuert werden.

Beispiele für Proteinkristalle, die durch temperaturgesteuerte oder temperatur- und niederschlagsgesteuerte kristallisation angebaut werden, sowie relativen Beugungsdaten sind in der Literatur und im PDB verfügbar. Darunter sind menschliche γ-Crystallin E, PA-IIL-Lectin, Hefe anorganische Pyrophosphatase, Urateoxidase, menschliche Kohlensäureanhydrase II, YchB-Kinase, und Lactat-Dehydrogenase5,14,17,18.

Obwohl OptiCrys von NatX-ray kommerzialisiert wurde, gibt es viele Laboratorien, die keinen Zugang zu diesem Instrument oder zu dem seriellen Ansatz haben, den es bietet. Die Alternative zu dieser Technik ist die Verwendung handelsüblicher Kunststoff-Mikrodialyseknöpfe mit unterschiedlichen Volumina. Mit diesen können Temperatur und chemische Zusammensetzung manuell eingestellt und variiert werden. Die Inspektion von Mikrodialyseknöpfen kann nicht vor Ort durchgeführt werden und muss stattdessen manuell mit einem optischen Mikroskop durchgeführt werden. Die Temperaturregelung kann erreicht werden, indem die Probe in einem vibrationsfreien, temperaturgeregelten Inkubator gehalten wird. Es ist wichtig, die Temperatur konstant zu halten, um sicherzustellen, dass Kristallisationsexperimente reproduzierbar sind. Erhebliche Temperaturschwankungen können auch zu Beschädigungen oder Zerstörungen von Kristallen führen5.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Beschreibung der Probenvorbereitung und des Einsatzes von Steuerungssoftware für das Wachstum großer, hochwertiger Kristalle bereit, die für die Neutronenproteinkristallographie geeignet sind. Dieses Schritt-für-Schritt-Verfahren wurde entwickelt, um das Kristallisationsphasendiagramm zu nutzen, um eine Startposition und einen kinetischen Pfad auszuwählen, um die Größe und die Qualität der erzeugten Kristalle zu steuern. Darüber hinaus wird ein detailliertes Protokoll für den Anbau von Kristallen mit Mikrodialyseknöpfen vorgestellt, das die gleiche Begründung verwendet, um große, hochwertige Kristalle zu erhalten.

Protocol

1. Dialysemethode mit Mikrodialyseknöpfen Probenvorbereitung Bereiten Sie die Proteinlösung vor, indem Sie 30 mg Hühnerei-weißes Lysozym als lyophilisiertes Pulver in 1 ml CH3COONa Puffer (100 mM Natriumacetat, pH 4) auflösen, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 30mg-mL -1zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Probe an der 13.000 × g für 10 min bei 277 K. Dieser Prozess hilft, alle Aggregate zu entfernen, bevor Sie den Kristallisationsprozess starten. Überprüfen Sie die Absorption der Probe bei 280 nm und berechnen Sie die Proteinkonzentration mit der Beer-Lambert-Gleichung (A= -cl).ANMERKUNG: Gemäß der Beer-Lambert-Gleichung ist die elektronische Absorption (A) direkt proportional zur Konzentration (c, mg-mL-1) einer absorbierenden Spezies mit konstanter optischer Pfadlänge (l, cm). Der Gradient dieser linearen Beziehung ist der molare Aussterbekoeffizient (ε, für Lysozym bei 280 nm ist 2,64 mL,mg1cm1)19. Die Seitenketten aromatischer Aminosäuren (Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin) und Disulfidbindungen zwischen Cysteinrückständen haben eine starke Absorption von 280 nm, die durch spektroskopisch erlaubte π – π*-Übergängeentungen entsteht. Da die meisten Proteine diese Rückstände enthalten, kann die Proteinkonzentration in der Regel leicht berechnet werden, indem die Absorption bei 280 nm gemessen wird, da sie den Aussterbekoeffizienten kennt. Bereiten Sie Kristallisationslösungen vor, wie in Abbildung 4dargestellt. Filtern Sie alle Lagerlösungen mit 0,22 m Millipore-Filtern, bevor Sie die Kristallisationslösung vorbereiten. Kristallwachstum Eine Cellulose-Dialysemembran mit entsprechendem Molekulargewichts-Cutoff (6-8 kDa) schneiden und in destilliertem Wasser einweichen.HINWEIS: Dialyse-Membranscheiben sind kommerziell für Mikrodialyse-Tasten erhältlich, aber wenn die Dialyseschläuche verwendet werden, vergessen Sie nicht, die Kanten zu schneiden, um die beiden Membranschichten vom Rohr zu trennen, um nur einschichtige Membranen zu haben. Füllen Sie die Bohrungen eines 24-Well-Trays mit 2 ml Kristallisationslösung in der gleichen Reihenfolge wie in Abbildung 4dargestellt.HINWEIS: Wenn Tasten mit größeren Volumina verwendet werden (z. B. 200 l), füllen Sie 50 ml-Rohre mit einer minimalen Kristallisationslösung von 5 ml, um einen effizienten Austausch zu gewährleisten. Add/Pipette 35 l Lysozymlösung in die Kammer des Mikrodialyseknopfes, wie in Abbildung 5Adargestellt.ANMERKUNG: Um die Bildung von Luftblasen in einer Dialysetaste von 30 l zu vermeiden, wenn sie geschlossen wird, muss ein zusätzliches Volumen (TotesVolumen) von 5 l zusätzlichem Protein hinzugefügt werden, d. h. insgesamt 35 l Proteinprobe. Diese zusätzliche Proteinprobe erzeugt eine leicht gewölbte Form auf der Oberseite der Kammer, wie in Abbildung 5Bdargestellt, die die Bildung von Luftblasen verhindert. Nehmen Sie einen Applikator der entsprechenden Größe und platzieren Sie den elastischen O-Ring an seiner Extremität (Abbildung 5C). Dann legen Sie die Membran, zuvor leicht abgewischt / entwässert mit einem Stück faserfreiem Papier, auf die Kammer des Dialyseknopfes. Achten Sie darauf, beim Auftragen des Papiers keinen Staub in die Kammer zu legen. Setzen Sie die Dialysemembran ein, indem Sie den elastischen O-Ring vom Applikator auf die Nut der Dialysetaste übertragen (Abbildung 5C).HINWEIS: Der kritische Moment der Handhabung ist die Befestigung der Dialysemembran auf der Oberseite der Kammer, indem der elastische O-Ring vom Applikator in die Nut des Dialyseknopfes übertragen wird. Alle Bewegungen müssen perfekt synchronisiert sein, um Luftblasen nicht mit der Probe in der Proteinkammer einzuschließen. Es ist nützlich, zu üben, den elastischen O-Ring vor seiner Anwendung zu dehnen, um seine Steifigkeit zu kennen, eine Pinzette zu verwenden, um einen Teil der Membran während seiner Anwendung zu halten und die ersten Testexperimente mit einem Modellprotein durchzuführen. Übertragen Sie die Taste mit einer Pinzette auf den Brunnen oder auf das 50 ml-Rohr (Abbildung 5D). Bedecken Sie den Brunnen mit einem Deckelschlupf, und drücken Sie ihn sanft auf das Fett, um den Brunnen zu versiegeln (Abbildung 5E).HINWEIS: Wenn sich kein Fett auf den Brunnen befindet, sollten Sie dies vor Beginn des Experiments hinzufügen oder ein Stück Klebeband anstelle eines Glasdeckels verwenden. Das Prinzip der Proteinkristallisation mit Mikrodialyseknöpfen ist in Abbildung 5dargestellt. Bewahren Sie die Probe bei 293 K in einem thermoregulierten Inkubator auf. Je nach den verwendeten Protein- und Kristallisationsbedingungen können unterschiedliche Temperaturen erforderlich sein.ANMERKUNG: Das gleiche Raster der Kristallisationsbedingungen, das in Abbildung 4 dargestellt ist (damit die Konzentration des Niederschlagsmittels variiert werden kann) kann als Funktion der Temperatur abgeschirmt werden. In einem solchen Fall muss dieselbe Kristallisationsplatte reproduziert und jede Kopie in einem Inkubator platziert werden, der bei einer anderen Temperatur reguliert ist. Dazu sind mehrere vibrationsfreie thermoregulierte Inkubatoren verfügbar. Überprüfen Sie das Fach oder die Rohre auf Kristalle(Abbildung 4) und machen Sie sich regelmäßig Notizen, in der Regel täglich, um zu unterscheiden, was in jedem Fach ist. Gute Noten sind unerlässlich, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden und Staub von Kristallen zu unterscheiden. 2. Kristallwachstumsprozess mit OptiCrys Probenvorbereitung Bereiten Sie eine Proteinlösung und eine Dialysemembran wie in Abschnitt 1.1 beschrieben vor. Bereiten Sie Lagerlösungen von NaCl (4 M) und CH3COONa pH 4 (1 M) vor und filtern Sie sie in 50 ml Rohre. Fügen Sie die Proteinlösung (15 l Lysozym mit 30mg-mL -1) in die Dialysekammer des temperaturgesteuerten Fließreservoir-Dialyse-Setups ein. In Abbildung 6 finden Sie Details zum temperaturgesteuerten Diauchsystem-Dialyse-Setup. OptiCrys hat zwei Dialysekammern, das Mindestvolumen beträgt 15 l und das maximale Volumen 250 l. Bedecken Sie den Überraum mit einer Dialysemembran und fixieren Sie die Membran mit dem elastischen O-Ring (Abbildung 6B).HINWEIS: Dieses Setup unterscheidet sich von Mikrodialyseknöpfen, bei denen jede Kammer direkt durch eine Dialysemembran versiegelt wird. In der Durchflusszelle wird die Dialysemembran stattdessen an der Überkammer befestigt, so dass Kristalle ohne entfernungsfrei montiert werden können. Zu diesem Zweck kann die Überkammer einfach aus dem Reservoir abgeschraubt werden. Drehen Sie die Überkammer und legen Sie sie auf die Dialysekammer. Drücken Sie es langsam und vorsichtig, um die gesamte Luft zwischen den beiden Stücken einzufangen und Blasen in der Kammer zu vermeiden (Abbildung 6C). Das Üben mit einem Modellprotein kann beim Training zur Vermeidung von Luftblasen und Probenverlust von Vorteil sein. Befestigen Sie das Reservoir in seiner Position, indem Sie es vorsichtig auf die Oberseite der Überkammer schrauben, wieder achtsam sein, um Luftblasen zu vermeiden. Eine Überstraffung des Reservoirs kann auch Blasen in der Kristallisationskammer bilden (Abbildung 6D). Fügen Sie die Kristallisationslösung hinzu und decken Sie die Reservoirkammer mit der luftdichten Kappe ab. (Abbildung 6G). Das maximale Volumen des Reservoirs beträgt 1 ml. Übertragen Sie diese Baugruppe und legen Sie sie in die Messinghalterung ein. Diese Unterstützung ist in Kontakt mit Peltier-Elementen, die zur Temperaturregelung verwendet werden. Wie in Abbildung 6dargestellt, ist die luftdichte Kappe mit einem optischen Fenster ausgestattet, um eine obere Ausleuchtung der Dialysekammer zu ermöglichen. Setzen Sie die Lichtquelle (Abbildung 2) auf das Fenster, so dass Licht durch die Kammer gehen kann. Die Reservoirkammer kann an eine Pumpe angeschlossen werden, damit sie als durchgehende Durchflusszelle fungieren kann. Schließen Sie die Schläuche auf den 50 ml-Rohren, die die Lagerlösungen und destilliertes Wasser enthalten, an das Drehventil an,wie in Abbildung 7 dargestellt.HINWEIS: Wenn während des Experiments keine automatische Vorbereitung und änderung von Kristallisationslösungen gewünscht werden, lassen Sie Schritt 2.1.10 weg. In einem solchen Fall muss die Kristallisationslösung vorbereitet und das Reservoir manuell vorgefüllt werden. Software Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software Croissance cristalline [Crystal growth]. Diese Steuerungssoftware wurde mit LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) geschrieben und bietet eine benutzerfreundliche grafische Oberfläche. Es enthält 4 verschiedene grafische Schnittstellen (Accueil [Willkommen], Paramétrage [Setting], Essai [Test] und Maintenance [Maintenance]) (Abbildung 8).HINWEIS: Übersetzungen aus dem Französischen sind in Klammern. Wählen Sie die Wartungsansicht aus, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, wie in Abbildung 8dargestellt. Diese Ansicht wird derzeit am häufigsten verwendet und ermöglicht es Benutzern, die meisten Parameter während des Experiments zu steuern.HINWEIS: Nachdem Sie auf die Wartungsansicht geklickt haben, erscheint ein neues Fenster mit verschiedenen Abschnitten zur Steuerung von Parametern wie Temperatur oder Licht. In Abbildung 8 werden verschiedene Teile dieser Ansicht mit Pfeilen und Rahmen dargestellt. In den folgenden Schritten zeigen wir, wie jeder Parameter über die Software gesteuert wird. Der Abschnitt Régulateur de température [Temperaturregler] ermöglicht die Steuerung und Überwachung der Temperatur. Klicken Sie auf die Schaltfläche Nummer 1 (1) in Abbildung 8, um sie einzuschalten.HINWEIS: Der Temperaturbereich in OptiCrys beträgt 233,0 – 353,0 ± 0,1 K. Stellen Sie die Temperatur auf dem Abschnitt “Zielpunkt] ein und drücken Sie die Eingabetaste (Abbildung 8(2)). Unterhalb dieser Schaltfläche befindet sich ein Diagramm mit 2 Spuren (rot und gelb). Die rote Spur zeigt die endgültige (geordnete) Temperatur und die gelbe Spur die aktuelle Temperatur. Wie in Abbildung 8(2)dargestellt, wird die Temperatur auf 20 °C eingestellt.HINWEIS: Um einen Kristall anzubauen, wie im Kristallwachstumsabschnitt erklärt, müssen viele Temperaturen gewählt werden. Um die Temperatur zu ändern, fügen Sie jede neue Temperatur im Abschnitt “Zielpunkt] “Empfänger” hinzu, und drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur. Schalten Sie das Licht ein, indem Sie die Leuchtkraft aus dem Abschnitt Lumiéres [Lichter] in Abbildung 8erhöhen. Die Leuchtkraft reicht von 0 bis 100, “0” zeigt an, dass das Licht ausgeschaltet ist und bei “100” wird das Licht auf maximale Intensität und Helligkeit eingestellt. Durch die Erhöhung des Lichts kann man im Mikroskopbereich in der Dialysekammer sehen. Während des Experiments kann die Helligkeit in der Zelle variieren; passen Sie die Parameter an, um sie innerhalb der Dialysekammer deutlich zu visualisieren. Die Vergrößerung kann auch erhöht oder verringert werden, indem Sie die Tasten + und – vor “Zoom” für eine bessere Anzeige verwenden. Auf der rechten Seite des Mikroskop-Abschnitts gibt es mehrere Abschnitte, in denen relevante Informationen für jedes Kristallisationsexperiment gespeichert werden können. Jeder Benutzer kann einen Ordner erstellen, um Informationen über Kristallisationsbedingungen, Proteinnamen und die Molekulargewichtsabschaltung der verwendeten Dialysemembran zu speichern (Abbildung 8(3)). Der Benutzer kann einen Namen für das Experiment definieren, indem er ihn einfach in das Nom Dossier [Ordnername]eingibt. Ein Klick auf die Schaltfläche Dossier [Ordner] (angezeigt mit einem grünen Rahmen in Abbildung 8) öffnet ein neues Fenster. In diesem Fenster wird eine Textdatei angezeigt, die alle für das Experiment definierten Informationen enthält. Darüber hinaus werden mit Zeitstempel versehene Bilder in diesem Ordner für die zukünftige Verarbeitung gespeichert. Wählen Sie im Abschnitt NB Images die Anzahl der Bilderaus, die während des Experiments aufgenommen werden sollen. Geben Sie die Anzahl der Bilder im rechten Bereich zusammen mit dem gewünschten Zeitintervall zwischen diesen an (z. B. min, Stunde, Tag). Abbildung 8 zeigt das Software-Setup, um null Bilder in einer Minute aufzuzeichnen.HINWEIS: Verwenden Sie den Abschnitt Pompe [Pump] zum Mischen von Lagerlösungen und injizierender Kristallisationslösung in die Reservoirkammer. Siehe Abschnitt 2.1.10 und Abbildung 7 für eine Erläuterung des Prinzips des Fluidmischsystems. Eingangskonzentrationen der Lagerlösungen in Etape 1 [Schritt 1]: Lösungsbestände. Für das Kristallisationsexperiment im nächsten Abschnitt werden NaCl 4 M und CH3COONa 1 M pH 4 verwendet.HINWEIS: Die Konzentrationen von Lagerlösungen sind in Moleinheiten. Definieren Sie die endgültige Konzentration jeder Lösung. Zum Beispiel 0,75 M für NaCl und 0,1 M für CH3COONa pH 4. Geben Sie diese im letzten Konzentrationsabschnitt (Abbildung 8) in das Etape 2 [Schritt 2]: Lösung -préparer [Zubereitende Lösung] ein. Drücken Sie die Schaltfläche Calcul [Compute], die in Abbildung 8mit einem roten Rahmen dargestellt wird. Das Endvolumen jeder Lagerlösung, die beim Mischen verwendet wird, wird im Volumenpanel vor jeder Konzentrationsplatte angezeigt. Drücken Sie die Lancer préparation [Launch preparation] Taste (Abbildung 8). Wie in Abbildung 7dargestellt, nimmt das Drehventil jede Lagerlösung und injiziert sie über einen Schalter in das Mischrohr. Nachdem die Kristallisationslösung vorbereitet wurde, klicken Sie auf die Entrée-Lösungstaste [Solution Entry] in Etape 3 [Schritt 3]: Flux des Pumpenabschnitts (gelber Rahmen in Abbildung 8). Der Schalter wechselt, um die neue Kristallisationslösung aus dem Mischrohr in die Reservoirkammer zu injizieren. Um den Austauschvorgang zu beenden, drücken Sie die Schaltfläche “Arrét-Verteilung [Verteilungstop]”.HINWEIS: Beobachten Sie den Kristallisationsprozess während des Experiments und ändern Sie Parameter wie Temperatur, Kristallisationslösung und Zoom in der entsprechenden grafischen Oberfläche der Überwachungssoftware. Durch die Verwendung der Software besteht keine Notwendigkeit, die luftdichte Kappe oder die Durchflusszelle während des Experiments zu entfernen, so dass die einzige Variable diejenige ist, die der Benutzer durch die Software ändert. Großes Kristallwachstum Fügen Sie der Dialysekammer 15 l Lysozym mit einer Konzentration von 30mg-mL -1 hinzu (Abbildung 6A).HINWEIS: Bereiten Sie die Proteinprobe wie in Abschnitt 1.1 beschrieben vor. Montieren Sie den temperaturgeregelten Rückflussbehälter-Dialyse-Setup, wie in Abschnitt 2.1 und Abbildung 6beschrieben. Bereiten Sie die Kristallisationslösung vor. Vergessen Sie nicht, alle Lagerlösungen vor der Probenvorbereitung mit 0,22 m Filtern zu filtern. Für dieses Experiment enthält die Kristallisationslösung 0,75 M NaCl und 0,1 M CH3COONa pH 4. Diese kann manuell oder mit der Reservoirkammer und dem Pumpsystem wie in den Abschnitten 2.2.10 bis 2.2.12 beschrieben hinzugefügt werden. Stellen Sie die Temperatur auf 295 K, wie in den Abschnitten 2.2.3 und 2.2.4 erläutert und in Bild 8 dargestellt. Unter den Ausgangsbedingungen wird das Gleichgewicht zwischen der Dialysekammer und dem Reservoir nach ca. 90 Minuten erreicht und die ersten sichtbaren Kerne erscheinen nach 22 Stunden. Lassen Sie Kristalle wachsen, bis keine sichtbaren Veränderungen in der Größe der Kristalle beobachtet werden(Abbildung 9, Panel 1).HINWEIS: Um die Keimzeit zu bestimmen und die Variation in der Größe der Kristalle zu messen, nehmen Sie Bilder alle 15 oder 20 min auf, was 4 bzw. 3 Bildern pro Stunde im Abschnitt NB-Bilder entspricht. Für die In-situ-Beobachtung der Proteindenaturierung, Aggregation und Niederschlag oder Kristallauflösung oder Keimbildung sind in der Regel zwischen wenigen Sekunden und einigen Dutzend Minuten erforderlich. Für das Kristallwachstum liegt dieser Bereich jedoch zwischen ein paar Minuten und einigen Stunden. Nach drei Tagen, senken Sie die Temperatur auf 291 K, um das Kristallwachstum wieder aufzunehmen. Halten Sie die Temperatur konstant und lassen Sie den Kristall entwickeln(Abbildung 9, Panel 2). Für diese Phase des Experiments reicht es aus, alle 2 Stunden Bilder aufzuzeichnen und alle 10 bis 12 Stunden nach einer Änderung der Größe der Kristalle zu suchen. Das Experiment kann fortgesetzt werden, wenn keine Änderung der Größe der Kristalle beobachtet wird.HINWEIS: Abhängig von den Protein- und Niederschlagskonzentrationen in der Kristallisationslösung und den verwendeten Proteinmengen kann die Zeit, die benötigt wird, um das Gleichgewicht für jeden Schritt zu erreichen, variieren. Verringern Sie die Temperatur auf 288 K, um das Kristallwachstum wieder aufzunehmen. In dem hier vorgestellten experimentellen Zustand des Falles reicht ein Tag aus, um das Gleichgewicht zu erreichen(Abbildung 9, Panel 3). Überprüfen Sie die Größe der Kristalle und halten Sie eine konstante Temperatur, solange der Kristall weiter wächst. Nach 4 Tagen die Temperatur auf 275 K senken, um das Kristallwachstum neu zu starten(Abbildung 9,Panel 4).– In den experimentellen Bedingungen des dargestellten Falles wird nach etwa 10 Tagen ein Kristall erhalten, der 500 m in einer Dimension ist (Abbildung 9). Steuerung der Kristallgröße Bereiten Sie eine Proteinlösung und die temperaturgeregelte Fließbehälterdialyse vor, wie in den Abschnitten 2.3.1 und 2.3.2 beschrieben. Bereiten Sie Kristallisationslösungen mit 0,9 M NaCl und 0,1 M CH3COONa pH 4 vor. Stellen Sie die Temperatur auf 291 K ein und lassen Sie Kristalle wachsen. Unter den ersten Bedingungen beginnt das erste Keimereignis nach etwa einer Stunde und zahlreiche Kristalle wachsen drei Stunden lang in der Dialysekammer(Abbildung 10, Schritte: 1 und 2). Zeichnen Sie Alle 20 Minuten Bilder auf, um die Größe der Kristalle während des Wachstumsprozesses zu überprüfen.HINWEIS: Die Optimierung der Kristallisationsbedingungen ist entscheidend für die Kontrolle der meisten Endeigenschaften erzeugter Kristalle. Die Temperatur und chemische Zusammensetzung von Kristallisationslösungen kann geändert werden, um Kristalle von gleichmäßiger Größe aufzulösen und nachzuwachsen. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass eine Proteinprobe in einem solchen Experiment nicht verbraucht wird, da die Bedingungen umgekehrt werden können, um die Probe wieder aufzulösen, solange sie nicht denaturiert ist. Wenn Sie Kristalle auflösen, indem Sie die Temperatur ändern und eine konstante chemische Zusammensetzung beibehalten, setzen Sie das Experiment wie folgt fort: Sobald Kristalle bei 291 K gewachsen sind, können diese aufgelöst werden, um weniger, größere Kristalle wieder zu wachsen. Erhöhen Sie die Temperatur schrittweise über 20 min, um 313 K zu erreichen. Es dauert etwa eine Stunde, um alle Kristalle in der Dialysekammer aufzulösen(Abbildung 10, Schritte: 3-5). Zeichnen Sie Bilder alle 5 bis 15 Minuten auf, um den Auflösungsprozess zu überwachen.HINWEIS: Viele Proteine reagieren empfindlich auf hohe Temperaturen. Achten Sie darauf, innerhalb des Temperaturbereichs zu arbeiten, in dem das Protein stabil ist, um Schäden/Denaturierungen zu vermeiden. Neben der Proteinlöslichkeit wirkt sich die Temperatur auch auf die Pufferlösung aus. Beispielsweise kann sich der pH-Wert des Puffers mit der Temperatur ändern, insbesondere im Tris-Puffer. In einem solchen Fall ist es entscheidend, den pH-Wert entsprechend der Temperatur einzustellen, bei der das Experiment18durchgeführt wird. Es sollte auch beachtet werden, dass die Proteinauflösung deutlich weniger Zeit (von ein paar Minuten bis zu einigen Stunden) im Vergleich zum Proteinkristallwachstum (von ein paar Stunden bis zu einigen Tagen) in Anspruch nimmt. Im Allgemeinen steigt während der Auflösung der Kristalle die Temperatur allmählich und langsam (unter Berücksichtigung der kurzen Gesamtauflösungszeit), vor allem im Falle einer teilweisen Auflösung der Kristalle, um die Zunahme der Kristallmosaik zu vermeiden. Wenn die Kristalle wachsen, kann die Temperatur schnell (in weniger als einer Minute) auf die eingestellte Temperatur (unter Berücksichtigung der langen Gesamtwachstumszeit) sinken. Eine regelmäßige Überwachung der Kristallisationskammer durch Aufnahme von Bildern ist ratsam, um Schäden am Protein zu verhindern und die optimale Zeit für die Auflösung oder das Wachstum von Kristallen für jedes untersuchte Protein zu definieren. Nachdem sich alle Kristalle aufgelöst haben, wird die Temperatur auf 295 K eingestellt, um ein zweites Keimereignis zu initiieren(Abbildung 10, Schritte: 6,7). Zeichnen Sie Bilder alle 5 Minuten auf, um den zweiten Keimprozess zu überwachen. In diesem Schritt erscheinen die ersten Kerne nach etwa 18 Minuten.HINWEIS: Bei dieser Temperatur befindet sich die Lösung in der Keimzelle, in der Nähe der metastabilen Zone. Dadurch werden nur wenige Kerne in der Kristallisationskammer erscheinen. Setzen Sie das Experiment fort, indem Sie den in Abschnitt 2.3 beschriebenen Optimierungsworkflow für den Anbau größerer Kristalle wiederholen. Die Gesamtdauer des in Abbildung 10 dargestellten Experiments beträgt nur wenige Tage.HINWEIS: Wenn während der Keimungsphase die Kristalle zu unterschiedlichen Zeiten erscheinen, werden Kristalle unterschiedlicher Größe in der Kristallisationskammer erhalten. In einem solchen Fall führt der Temperaturanstieg (bei Proteinen mit direkter Löslichkeit) zu einer schnelleren Auflösung der kleineren Kristalle. Je nach kinetischem Reifeeffekt kann das zusätzliche Protein (aus Auflösung gewonnen) dann für das Wachstum der größeren Kristalle verwendet werden.Wenn Sie Kristalle bei konstanter Temperatur auflösen, indem Sie die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung ändern, setzen Sie das Experiment wie folgt fort:Es ist auch möglich, zuvor gewachsene Kristalle aufzulösen, indem die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung während des Experiments geändert wird, um eine Population von gleichbleibend großen Kristallen unter neuen Bedingungen wieder anzubauen. Bereiten Sie die Proteinlösung (2.3.1), den temperaturgeregelten Fließbehälter-Dialyseaufbau (2.1) und die Kristallisationslösung (2.4.2) wie oben beschrieben vor. Unter den Ausgangsbedingungen in der Keimungszone weit weg von der metastabilen Zone werden zahlreiche kleine Kristalle in der Kristallisationskammer erscheinen und zu wachsen beginnen(Abbildung 11, Schritte: 1,2). Nach drei Stunden, wenn viele mittelgroße Kristalle in der Kristallisationskammer sichtbar sind(Abbildung 11, Schritt: 3), verringern Sie die NaCl-Konzentration (0,9 M) allmählich auf Null. Bereiten Sie dazu eine neue Kristallisationslösung vor, die nur eine Pufferlösung mit 0,1 M CH3COONa pH 4 enthält. Verwenden Sie das Pumpsystem, um es mit der Kristallisationslösung in der Reservoirkammer auszutauschen. Befolgen Sie die Schritte 2.2.10 bis 2.2.12 für die Herstellung und Injektion einer neuen Lösung in die Reservoirkammer. Mit dieser neuen Lösung nimmt die NaCl-Konzentration beim Austausch von Lösungen in der Kammer ab, bis die in der Reservoirkammer nicht mehr als 0,1 M CH3COONa pH 4 und keine NaCl enthält. Erfassen Sie alle 10 Minuten Bilder, um den Auflösungsprozess aufzuzeichnen. Lassen Sie die Kristalle vollständig auflösen (Abbildung 11, Schritte: 4,5). Die Auflösungszeit beträgt etwa zwei Stunden für dieses Experiment. Wie bereits erwähnt, hängt die Auflösungszeit vom verwendeten Proteinsystem, den Kristallisationsbedingungen und dem verwendeten Dialysekammervolumen ab. Eine regelmäßige Beobachtung der Kristallisationskammer (siehe Mikroskopbereich) und die Aufzeichnung von Bildern und Notizen während des Experiments sind unerlässlich. Wenn alle Kristalle in der Kammer gelöst sind(Abbildung 11, Schritt: 5), verwenden Sie das Pumpsystem erneut, um eine neue Kristallisationslösung vorzubereiten, indem Sie NaCl in einer niedrigeren Konzentration als die vorherige injizieren (0,75 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4). Injizieren Sie die neue Lösung in die Reservoirkammer(Abbildung 11, Schritte: 6,7) und wiederholen Sie den Inkristallisationswachstumsoptimierungsworkflow, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben. Es wird eine einheitliche Population größerer Kristalle erzeugt. Die in Abbildung 11 dargestellten Ergebnisse wurden nach einigen Tagen ermittelt.

Representative Results

In den Abschnitten 2.3 und 2.4 werden drei Beispiele für optimiertes Kristallwachstum vorgestellt, die den Einsatz des Instruments und ein experimentelles Design für den Anbau großer Kristalle zeigen. Für diese Demonstration haben wir Lysozym als Modellprotein verwendet, obwohl Kristallwachstumsexperimente mit vielen anderen Proteinsystemen mit dieser Methode erfolgreich durchgeführt wurden (siehe oben). Durch die Verwendung und Beherrschung des hier vorgestellten Protokolls kann man es für andere Proteinkandidaten anpassen. In Abschnitt 2.3 haben wir gezeigt, dass etablierte rationale Kristallisationsstrategien beim Anbau von Kristallen mit ausreichenden Streuvolumen für die Neutronenproteinkristallographie von Vorteil sein können. Hier zeigen wir, dass die vorgeschlagenen rationalen Optimierungsstrategien auch die Erzeugung einer einheitlichen Population von Kristallen jeder spezifischen Größe ermöglichen, die für nachgelagerte Strukturbestimmungsansätze erforderlich ist. Diese beiden Experimente sollen die Bedeutung von Phasendiagrammen bei der Steuerung von Kristallkernbildung und Wachstum hervorheben. Hier bei der Überwachung des qualitativen Phasendiagramms wird die Temperatur- und chemische Zusammensetzung von Kristallisationslösungen in Kombination mit der Überwachung des Kristallisationsprozesses in Echtzeit gesteuert. Mit dieser Methode können Keimbildung und Kristallwachstum auf reversible Weise rational optimiert werden. Die Verwendung eines solchen seriellen Ansatzes reduziert auch die Menge an Protein und die Zeit, die benötigt wird, um die Größe und Qualität der Kristalle zu kontrollieren. Bei der Dialysemethode wird eine Proteinlösung durch eine halbdurchlässige Membran6 (Abbildung 5) von einer Kristallisationslösung getrennt. Diese Dialysemembran ermöglicht es kleinen Molekülen wie Additiven, Puffern und Ionen, die Membran zu passieren, nicht aber Makromoleküle wie Proteine6,20. Mit dieser Funktion kann die Kristallisationslösung im Laufe des Experiments6modifiziert werden. Der Austausch der Lösung kann manuell erfolgen, z.B. in Mikrodialyse-Tasten, oder automatisiert mit einem dafür entwickelten Instrument OptiCrys8. In den ersten Experimenten wurden Mikrodialyseknöpfe zur Kristallisation von Hühnerei-weiß-Lysozym verwendet. Mikrodialyseknöpfe wurden in Kristallisationslösungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen eingetaucht. In diesem einfachen Kristallisationsgitterexperiment ist die einzige Variable die Niederschlagskonzentration, während die Temperatur konstant gehalten wird (293 K). Wie in Abbildung 4dargestellt, führen leichte Schwankungen der Salzkonzentration zu einer Veränderung der Größe und Anzahl der beobachteten Kristalle, was eine Untersuchung des Kristallisationsphasendiagramms ermöglicht. In Abbildung 4, Panel 1, enthält die Kristallisationslösung 0,7 M NaCl und eine begrenzte Anzahl größerer Kristalle sind in den Tasten erschienen. Durch die Erhöhung der Salzkonzentration von 0,7 auf 1,2 M steigt die Übersättigung und die Lösung in der Keimzone bewegt sich von der metastabilen Zone weg(Abbildung 4,Panels 1 bis 6). Infolgedessen nimmt die Anzahl der Kristalle zu und ihre Größe nimmt ab. Im ersten Experiment mit einem vollautomatischen Instrument zur temperaturgesteuerten Dialysekristallisation, OptiCrys (Abbildung 9), wurde das Kristallwachstumsexperiment auf ein großes Kristallwachstum zugeschnitten. Das Experiment wurde bei einer Anfangstemperatur von 295 K mit einer Kristallisationslösung mit 0,75 M NaCl und 0,1 M Naacetatpuffer pH 4 gestartet. Unter diesen experimentellen Bedingungen erreichte die Kristallisationslösung die Keimungszone in der Nähe der metastabilen Zone des Phasendiagramms(Abbildung 9, Pfeil 1). Infolgedessen wurden in der ersten Phase des Experiments nur wenige Kerne erzeugt. Um ausgewählte Kristalle weiter anzubauen (siehe Abbildung 9), wurde der Workflow zur Kristallwachstumsoptimierung durch unterschiedliche Temperatur in die metastabile Zone getrieben, sobald das Kristalllösungsgleichgewicht erreicht war. Jedes Mal, wenn das Gleichgewicht zwischen Kristall und Lösung erreicht wurde, wurde die Temperatur zuerst auf 291 K, dann auf 288 K und schließlich auf 275 K gesenkt, um die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone zu halten. Das Ergebnis dieses Experiments ist ein einziger großer Kristall, der sowohl für makromolekulare Röntgen- als auch für Neutronenkristallographie geeignet ist. Für die meisten Proteine wurde das genaue quantitative Phasendiagramm (oder nur ein qualitatives Diagramm) noch nicht erreicht, da es an experimentellen Geräten fehlt, die in der Lage sind, die Proteinkonzentration (oder nur die Beobachtung/Detektion des Kristallisationsprozesses in Echtzeit) während der Kristallisationsexperimente18genau zu messen bzw. zu erkennen/zu erkennen. Daher ist es oft nicht möglich, das Experiment so zu gestalten, dass die Kristallisation im optimalen Bereich des Phasendiagramms, in der Nähe der metastabilen Zone beginnt. Daher muss eine Kristallisationsoptimierungsstudie durchgeführt werden, bevor das Experiment durchgeführt wird, das dem Wachstum eines großvolumigen Kristalls gewidmet ist. In dieser Studie sind Temperaturschwankungen (bei konstanter chemischer Zusammensetzung) einerseits und Variationen der chemischen Zusammensetzung (bei konstanter Temperatur) andererseits erforderlich, um die metastabile Zone zu identifizieren und die optimalen Bedingungen für den Beginn eines großen Kristallwachstumsexperiments abzustecken. Zu diesem Zweck werden zwei weitere Experimente vorgestellt, die auf die Reversibilität der temperaturgesteuerten Dialysekristallisationsexperimente mit OptiCrys für Keimbildung, Kristallwachstum, Auflösung und Wiederwachstum zugeschnitten sind. Der Workflow zur Kristallwachstumsoptimierung wurde so gesteuert, dass eine gleichmäßige Population von weniger, größeren Lysozymkristallen unter Verwendung von Temperaturschwankungen oder Niederschlagskonzentrationen angebaut wurde. Im zweiten Experiment mit OptiCrys wurde die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung während des gesamten Experiments konstant gehalten (0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4) mit variabler Temperatur. Die Anfangstemperatur wurde auf 291 K eingestellt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abbildung 10zusammengefasst. Aufgrund der hohen Übersättigung tauchte eine große Anzahl kleiner Kristalle in der Kristallisationskammer auf(Abbildung 10, Panels 1 und 2). Gemäß dem Konzept der direkten Proteinlöslichkeit wurden durch allmähliche Erhöhung der Temperatur auf 313 K alle Kristalle aufgelöst(Abbildung 10, Panels 3, 4 und 5). Schließlich wurde durch Die Senkung der Temperatur auf 295 K die zweite Keimbildung in der Nähe der metastabilen Zone eingeleitet und ermöglichte die kontrollierte Bildung einer geringeren Anzahl von Kernen. Weiteres Kristallwachstum führte zur gleichmäßigen Erzeugung einer Population größerer Kristalle(Abbildung 10, Tafel 7). Wie in Abbildung 11dargestellt, kann eine Variation der chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösung bei einer konstanten Temperatur von 291 K ebenfalls verwendet werden, um eine gleichmäßige Population größerer Kristalle zu erhalten. Ähnlich wie beim vorherigen Experiment betrug die Ausgangsbedingung 0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4. Die NaCl-Konzentration wurde dann schrittweise von 0,9 M auf Null gesenkt, um die Kristalle aufzulösen(Abbildung 11, Panels 4 und 5). Zu diesem Zeitpunkt wurde NaCl vollständig durch eine Pufferlösung von 0,1 M CH3COONa pH 4 ersetzt. Durch die Reduzierung der Salzkonzentration bleibt die Lösung in der untergesättigten Zone des Phasendiagramms, was zur Auflösung der Kristalle führt. Anschließend wurde eine neue Kristallisationslösung mit geringerer Ionenfestigkeit bei 0,75 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4 in die Reservoirkammer injiziert. Bei dieser niederschlagsarmen Konzentration tauchten nach 90 Minuten die ersten Kerne auf(Abbildung 11, Tafel 6). Die Anzahl der erzeugten Kristalle war niedriger und die Kristalle erreichen ein größeres Volumen(Abbildung 11, Panel 7) als zuvor. Abbildung 1: Schematisches Phasendiagramm. Kinetische Bahnen für drei Kristallisationstechniken werden in einem Aussalzungsregime dargestellt. Jede Methode erreicht Nukleation und Kristallisation unterschiedlich, visualisiert durch einen anderen kinetischen Weg durch das Phasendiagramm, um die Nukleation und metastabile Zonen zu erreichen. Die Löslichkeitskurve trennt Untersättigungs- und Übersättigungsbereiche. Die Supersättigung ist in drei Zonen unterteilt: metastabil, Keimbildung und Niederschlag. In der Keimungszone tritt eine spontane Keimbildung auf, während in der metastabilen Zone Kristallwachstum stattfindet. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Schematische Darstellung der Kristallisationsbank (OptiCrys). Die LED-Lichtquelle befindet sich auf der temperaturgesteuerten Dialyse-Durchflusszelle. Ein invertiertes Mikroskop und die Digitalkamera werden oben rechts im Bild mit dem roten Pfeil angezeigt. Der rote Kreis stellt die Lage der Kühlerschläuche dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Schematisches zweidimensionales Proteinkristallisationsphasendiagramm in Abhängigkeit von Temperatur (A) und Niederschlagskonzentration (B). (A) Bei einem Protein mit direkter Löslichkeit hält die Temperaturabsenkung die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone. Temperaturschwankungen können mehrmals wiederholt werden, um den Kristallwachstumsprozess zu steuern, bis Kristalle mit dem gewünschten Volumen erhalten sind. (B) Eine Änderung der Konzentration der Niederschlagslösung kann auch verwendet werden, um die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone für den Anbau von Kristallen zu halten. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Kristalle von Lysozym, die mit der Dialysemethode gewonnen wurden. Dieses Experiment wurde bei einer konstanten Temperatur von 293 K in 0,1 M Natriumacetatpuffer pH 4 durchgeführt. Die Erhöhung der NaCl-Konzentration von 0,7 M auf 1,2 M erhöht die Keimbildung und führt zu einer größeren Anzahl von Kristallen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Überblick über den Proteinkristallisationsprozess durch die Dialysemethode. (A) Durch Zugabe des Proteins in die Kammer des Dialyseknopfes (B) wird eine Kuppelform auf der Oberseite der Kammer erzeugt. (C) Ein Applikator wird verwendet, um den O-Ring auf die Nut des Dialyseknopfes zu übertragen, um die Dialysemembran an Ort und Stelle zu fixieren. (D) Der Dialyseknopf ist zum Eintauchen in die Reservoirlösung bereit. (E) Die Kristallisationslösung durchläuft die halbdurchlässige Membran und Kristalle beginnen sich innerhalb der Kammer zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Schematische Ansicht des temperaturgesteuerten fließenden Dialyse-Setups. (A) Die Proteinprobe wird der Dialysekammer zugesetzt. (B) Die Dialysemembran wird mit einem Applikator mit einem O-Ring auf den Überraum fixiert. (C) Der Überkammerraum wird gedreht und an der Oberseite der Dialysekammer befestigt. Weiße Pfeile zeigen an, wo Schrauben auf der Überkammer platziert werden. (D) Die Reservoirkammer wird im Uhrzeigersinn (E) gedreht und auf der Oberseite des Überkammers befestigt. (F) Die Reservoirkammer wird durch eine luftdichte Kappe mit Anschlüssen an ein Pumpsystem abgedeckt und (G) die Durchflusszelle in den Messingträger gelegt. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Vorbereitung und Injektion der Kristallisationslösung im Reservoir durch das Fluidsystem (A). Salz- und Wasserenthaltende Rohre sind mit dem Druck-/Vakuumregler (B) und dem Drehventil (C) verbunden. Durch den Einsatz des Drucks erzeugt der Druck-/Vakuumregler einen konstanten Flüssigkeitsfluss von den Rohren zum Drehventil. Jede Flüssigkeit, die durch den Durchflussmesser (D) und den Schalter fließt, wird in das Mischrohr (F) injiziert. Sobald alle Flüssigkeiten dem Mischrohr zugesetzt wurden, injiziert der Schalter durch einige Modifikationen die aus dem Mischrohr in das Reservoir (G). Die Flüssigkeit fließt durch das System in Richtung der Pfeile im Diagramm, das in aufsteigender Reihenfolge markiert ist (von 1 bis 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Wartungsansicht der Überwachungssoftware. Diese Ansicht wird verwendet, um verschiedene Parameter wie Temperatur, Licht, Kristallisationslösung und Zoom zu steuern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: Das Phasendiagramm als Funktion der Temperatur (ausgewählte Bilder sind in aufsteigender Reihenfolge zu verfolgen). Ein einziger großer Lysozymkristall wird durch systematische Temperaturänderung von 295 K auf 275 K gewonnen. Bei jedem Schritt wird das Kristallwachstum gestoppt, wenn die Löslichkeitskurve erreicht wird. Die Reduzierung der Temperatur durch Beibehaltung der Lösung in der metastabilen Zone startet das Kristallwachstum neu. Die Bilder haben unterschiedliche Vergrößerungsstufen. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8,18Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 10: Optimierung des Kristallwachstums bei konstanter chemischer Zusammensetzung mittels Temperaturregelung (ausgewählte Bilder sind in aufsteigender Reihenfolge nachzuverfolgen). Der Beginn des Keimbildungsprozesses in der Keimungszone bei 291 K, weit weg von der metastabilen Zone, führt zur Bildung zahlreicher Kristalle. Durch die Erhöhung der Temperatur auf 313 K werden die Kristalle aufgelöst, bis in der Dialysekammer keine sichtbaren Kerne zu sehen sind. Schließlich wird die Temperatur auf 295 K zum zweiten Mal wieder aufgenommen, was zu einer begrenzten Anzahl größerer Kristalle führt. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8,18Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 11: Optimierung des Kristallwachstums bei konstanter Temperatur unter Verwendung von Schwankungen der Niederschlagskonzentration (ausgewählte Bilder sind in aufsteigender Reihenfolge zu verfolgen). Durch die Verringerung der Niederschlagskonzentration von 0,9 M auf 0 M werden die Kristalle aufgelöst, die während des ersten Keimereignisses erhalten wurden. Der Kristallisationsprozess wird durch die Injektion des gleichen Niederschlags, aber bei geringerer Ionenstärke, 0,75 M, neu gestartet, was zur Bildung einiger größerer Kristalle führt. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8,18Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Verschiedene physikalische, chemische und biologische Variablen beeinflussen die Proteinkristallisation, indem sie die Proteinlöslichkeit beeinflussen21. Unter diesen Variablen werden hier Temperatur und chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung in Kombination mit Dialysetechnik verwendet, um große hochwertige Kristalle von Biomakromolekülen für Neutronenbeugungsstudien zu verbessern und zu züchten. Durch die Verwendung von Kenntnissen von Phasendiagrammen wird die Kristallisation vorhersehbarer. Obwohl auch das Screening unterschiedlicher Kristallisationsbedingungen in einem seriellen Ansatz möglich ist, besteht das Hauptziel der Verwendung der vorgestellten rationalen Ansätze darin, die Kinetik der Kristallkernbildung und des Wachstums zu trennen und zu kontrollieren.

Ähnlich wie bei allen Kristallisationsstudien erhöhen hochwertige reine und homogene Proteinproben und staubfreie Kristallisationslösungen die Erfolgsrate des Experiments. Filtration und Zentrifugation von Lösungen sind wesentliche Schritte in den beschriebenen Protokollen. Die Kenntnis der physikalisch-chemischen Eigenschaften der untersuchten Proteine wie das Molekulargewicht (zur Wahl der geeigneten Dialysemembran), der isoelektrische Punkt und die Proteinlöslichkeit sind entscheidend für die Entwicklung eines optimalen Kristallwachstumsexperiments. Außerdem muss die Proteinstabilität bei unterschiedlichen Temperaturen oder mit unterschiedlichen Chemikalien berücksichtigt werden, um Probenverlust zu verhindern und die Erfolgswahrscheinlichkeit zu erhöhen. Unter Berücksichtigung des Temperaturbereichs von OptiCrys (233.0–353.0 ± 0.1 K) kann mit ihm ein breites Spektrum an Proteinen kristallisiert werden. Aber es lohnt sich zu betonen, dass Proteine, die in erster Linie thermostabil sind, wie Proteine aus thermophilen Quellen, am meisten von temperaturgeregelten großvolumigen Kristallwachstumsexperimenten profitieren würden, die von diesem Instrument angeboten werden.

Mit einer niedervolumigen Dialysekammer (bei Verwendung von OptiCrys) oder Mikrodialyseknöpfen und Demonsierung mehrerer Temperaturen und Kristallisationsbedingungen (z. B. Raster mit Niederschlagskonzentration oder pH) ist es möglich, Informationen über die Position der Grenze der metastabilen Zone (kinetisches Gleichgewicht zwischen Keimbildung und metastabilen Zonen) zu erhalten. Dies ist von unschätzbarem Wert, wenn ein erfolgreiches Kristallwachstumsexperiment speziell für neue Proteinkandidaten in der Kristallisation entwickelt wird. Ohne diese Informationen können Experimente aus einem Bereich des Phasendiagramms mit hoher Übersättigung beginnen, zu weit von der Grenze der metastabilen Zone entfernt, um die Kristallkernbildung leicht zu kontrollieren. Obwohl bei Proteinen mit reduzierter Thermostabilität die Auflösung des Proteinausfällungs versucht werden kann, z. B. durch Erhöhung der Temperatur bei direkter Löslichkeit, kann die Beibehaltung der Probe bei hoher Temperatur für einen längeren Zeitraum die Proteinfällung irreversibel machen. Daher besteht die beste Strategie darin, eine Ausgangsbedingung mit geringerer Übersättigung in der Nähe der Grenze der Metastabilität zu verwenden, wo die Keimbildung kontrolliert und Proteinfällungen vermieden werden können. Entsprechend verringert das Kristallisations-Prescreening die Wahrscheinlichkeit, dass ein Protein in der Dialysekammer ausfällt, und erhöht die Erfolgsrate des Experiments.

Nach dem Entwerfen eines Experiments ist die Vorbereitung von Dialysekammern (OptiCrys) oder Mikrodialyseknöpfen ein weiterer wichtiger Schritt. Die Verhinderung der Bildung von Luftblasen in der Dialysekammer/Knopf erhöht die Chance auf eine erfolgreiche Kristallisation, insbesondere wenn kleine Volumina verwendet werden. Das Vorhandensein von Luftblasen in der Dialysekammer kann auch die Kinetik des Kristallisationsprozesses verändern und die Reproduzierbarkeit des Experiments verringern (weil die Protein-/Lösungskontaktfläche modifiziert wurde). Nicht nur Protein, sondern auch Kristallisationslösung kann den Erfolg des Experiments beeinflussen. Die Verwendung neuer 50 ml Rohre für das Pumpsystem jedes Mal, wenn man ein neues Experiment starten will und Waschen Vonrohre nach jedem Experiment verringert die Chance der Kontamination und vermeidet die Bildung von Salzkristallen im Gerät.

Die Verwendung von Mikrodialyse-Tasten ist eine Alternative, wenn OptiCrys nicht verfügbar ist. Die oben genannten Strategien zur Optimierung der Kristallisation und zur Überwachung des Kristallwachstums müssen manuell durchgeführt werden. Typischerweise erfordert dies, dass man sich außerhalb eines thermoregulierten Inkubators befindet, was problematisch sein kann, wenn die Temperaturregulierung ein kritischer Schritt in der beschriebenen Methodik ist. Dies erleichtert nicht die Veränderung der chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösungen oder die Überwachung des Kristallwachstums durch Bildgebung, so dass der Kristallwachstumsprozess nicht in Echtzeit gesteuert werden kann.

Die Kenntnis des Phasendiagramms ist die Grundlage für die Verwendung der Kristallisationsbank OptiCrys, um systematisch große, hochwertige Kristalle automatisiert anzubauen. Die Kontrolle physikalisch-chemischer Parameter wie Temperatur, Niederschlagskonzentration und pH-Wert während der Kristallisation verschiebt das Protein-Lösungs-Gleichgewicht in einer genau definierten kinetischen Bahn über das Phasendiagramm. Ergänzt wird dies durch den Einsatz einer Dialysemembran zur Einstellung des Massentransports und zur Schaffung eines kontrollierten Gradienten in der Kristallisationskammer, der die Größe und Qualität der Kristalle beeinflusst. Daher ist die Verwendung sowohl thermodynamischer Daten als auch kinetischer Bahnen unerlässlich, um den Kristallisationsprozess zu steuern, um hochwertige Kristalle zu züchten. Dank OptiCrys können systematische Phasendiagramme in einem multidimensionalen Raum mit einem seriellen Ansatz mit deutlich weniger Material als bisher untersucht werden. Um diese Methodik zu demonstrieren, stellen wir hier eine Fallstudie mit einem Modellprotein, Huhn Ei-weiß Lysozym. Durch die Verwendung und Beherrschung des hier vorgestellten Protokolls kann man es für echte Proteinsysteme5,14,17,18anpassen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS bestätigt die Unterstützung durch den LABEX VALO GRAL im Rahmen des Vertrags 2015. NJ würdigt das International Doctoral Research Program (Irtelis) der CEA für das PhD Fellowship. Die Autoren würdigen die Finanzierung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung mit der Nummer 722687. Die Autoren sind auch Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) und Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) für hilfreiche Gespräche und Einblicke dankbar. Die IBS erkennt die Integration in das Interdisziplinäre Forschungsinstitut von Grenoble (IRIG, CEA) an.

Materials

200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator
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References

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Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova – Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).
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