Structurele studies van biomacromolecules door kristallografie vereisen hoogwaardige kristallen. Hier demonstreren we een protocol dat kan worden gebruikt door OptiCrys (een volledig geautomatiseerd instrument ontwikkeld in ons lab) en / of microdialyseknoppen voor het kweken van grote hoogwaardige kristallen op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.
Het gebruik van neutronen macromoleculaire kristallografie (NMX) breidt zich snel uit met de meeste structuren die in het afgelopen decennium zijn bepaald dankzij de bouw van nieuwe NMX-bundellijnen en de toegenomen beschikbaarheid van structuurraffinaderingssoftware. De neutronenbronnen die momenteel beschikbaar zijn voor NMX zijn echter aanzienlijk zwakker dan gelijkwaardige bronnen voor röntgenkristallografie. Ondanks de vooruitgang op dit gebied zullen er altijd aanzienlijk grotere kristallen nodig zijn voor neutronendiffractiestudies, met name met de neiging om steeds grotere macromoleculen en complexen te bestuderen. Verdere verbeteringen in methoden en instrumentatie die geschikt zijn voor het kweken van grotere kristallen zijn daarom nodig om het gebruik van NMX uit te breiden.
In dit werk introduceren we rationele strategieën en een kristalgroeibank (OptiCrys) ontwikkeld in ons laboratorium die realtime observatie combineert door middel van een op microscoop gemonteerde videocamera met nauwkeurige geautomatiseerde controle van kristallisatieoplossingen (bijv. neerslagconcentratie, pH, additief, temperatuur). Vervolgens laten we zien hoe deze controle van temperatuur en chemische samenstelling het zoeken naar optimale kristallisatieomstandigheden vergemakkelijkt met behulp van modeloplosbare eiwitten. Grondige kennis van het kristallisatiefasediagram is cruciaal voor het selecteren van de uitgangspositie en het kinetische pad voor elk kristallisatie-experiment. We laten zien hoe een rationele aanpak de grootte en het aantal gegenereerde kristallen kan bepalen op basis van kennis van multidimensionale fasediagrammen.
Het begrijpen van de structuurfunctierelatie van eiwitten en het mechanisme van fysiologische paden is vaak afhankelijk van het kennen van de posities van waterstofatomen (H) en hoe lading wordt overgedragen binnen een eiwit1,2. Aangezien waterstofatomen röntgenstralen zwak verspreiden, kunnen hun posities alleen worden bepaald met röntgendiffractiegegevens met een zeer hoge resolutie (>1 Å)3,4. Omgekeerd kan neutronenkristallografie worden gebruikt om een nauwkeurige positie van waterstofatomen in biologische macromoleculen te verkrijgen, aangezien waterstof en deuterium (H2, isotoop van waterstof) atomen verstrooiingslengten van ongeveer gelijke grootte hebben als zuurstof, stikstof en koolstof5. Neutronenflux uit beschikbare neutronenbronnen is echter zwakker dan die van röntgenstralen, dus dit moet vaak worden gecompenseerd voor2,3. Dit kan worden bereikt door H uit te wisselen met H2 en/of het volume van kristallen te verhogen om de onsamenhangende verstrooiing van waterstof te verminderen en de signaal-ruisverhouding van diffractiebeelden te verhogen.
Er zijn verschillende kristallisatiebenaderingen (het bijbehorende schematische fasediagram wordt weergegeven in figuur 1) voor het verkrijgen van grote en hoogwaardige kristallen voor zowel röntgen- als neutronenbio-macromoleculaire kristallografie6. Bij dampdiffusie wordt een druppel bereid uit een mengsel van een eiwit en een kristallisatieoplossing in de loop van de tijd, door verdamping van water of andere vluchtige soorten, in evenwicht gehouden met een reservoir met een hogere concentratie neerslag van dezelfde kristallisatieoplossing. De toename van de concentratie van eiwitten en neerslag in de druppel leidt tot de oververzadiging die nodig is voor spontane nucleatie , gevolgd door kristalgroei in deze kernen6,7. Hoewel dampdiffusie de meest gebruikte techniek is voor het kweken van kristallen4, kan het kristallisatieproces niet nauwkeurig worden gecontroleerd8. In de vrije interface diffusiemethode verspreidt de kristallisatieoplossing zich in een geconcentreerde eiwitoplossing, waardoor het systeem heel langzaam wordt gericht op oververzadiging. Deze methode kan worden beschouwd als een batchmethode met een langzame mengsnelheid6,9,10,11,12. In de batchmethode wordt het eiwit snel gemengd met een kristallisatieoplossing die leidt tot snelle oververzadiging en op zijn beurt uniforme nucleatie met veel kristallen3,7. Deze methode is goed voor ongeveer een derde van alle structuren die momenteel in de Protein Data Bank worden gedeponeerd. De dialysemethode wordt ook gebruikt voor het kweken van hoogwaardige en goed diffracerende eiwitkristallen. In de dialysemethode verspreiden moleculen van neerslag zich vanuit een reservoir via een semi-doorlatend membraan in een aparte kamer met de eiwitoplossing. De kinetiek van equilibratie is afhankelijk van verschillende factoren, zoals temperatuur, membraanporiëngrootte en het volume en de concentratie van eiwitmonsters en kristallisatiemiddelen6.
Kristallisatiefasediagrammen kunnen worden gebruikt om verschillende toestanden van een eiwit te beschrijven als functie van verschillende fysische of chemische variabele3. Zoals geïllustreerd in figuur 1, kan elke kristallisatietechniek worden gevisualiseerd als het gebruik van een andere kinetische baan om de nucleatie en uitzaaibare zones van een dergelijk diagram6,10,13te bereiken . Dit geeft informatie over de oplosbaarheid van eiwitten en de eiwitconcentratie waarbij een thermodynamisch evenwicht tussen kristal en oplossing wordt waargenomen, waardoor de optimale omstandigheden voor nucleatie en groei worden gevonden3,14. In een tweedimensionaal fasediagram wordt de eiwitconcentratie geplot als functie van de ene variabele en de andere variabelen constant15. In een dergelijk fasediagram, wanneer de eiwitconcentratie onder de oplosbaarheidscurve ligt, bevindt de oplossing zich in het onderverzadigde gebied en treedt er geen nucleatie of kristalgroei op. Boven deze curve bevindt zich de oververzadigingszone waar de eiwitconcentratie hoger is dan de oplosbaarheidsgrens3,14. Dit is verder verdeeld in drie regio’s: de uitzaaibare zone, de spontane nucleatiezone en de neerslagzone. In de uitzaaibare zone is oververzadiging niet voldoende om nucleatie binnen een redelijke tijd te laten plaatsvinden, maar de groei van gezaaide kristallen kan plaatsvinden. Aggregatie en neerslag zijn favoriet in de neerslagzone, waar de oververzadiging te hoog is14,15.
Wanneer voldoende oververzadiging voor spontane nucleatie wordt bereikt, verschijnen de eerste kernen10. De groei van kristallen leidt tot een verlaging van de eiwitconcentratie totdat de oplosbaarheidsgrens is bereikt. Zolang de oververzadiging in de buurt van de oplosbaarheidscurve blijft, zal er geen significante verandering in de grootte van kristallen zijn. Er is echter aangetoond dat variaties in de temperatuur en chemische samenstelling van kristallisatieoplossing (bijvoorbeeld de concentratie neerslag) de oplosbaarheid van eiwitten zullen beïnvloeden en kunnen leiden tot het initiëren van verdere kristalgroei8,13,16.
Aangezien dialyse voordelig is voor kristalgroei van goede kwaliteit, werd de OptiCrys kristallisatiebank geïllustreerd in figuur 2,ontworpen en ontwikkeld in ons laboratorium om kristallisatie op een volledig geautomatiseerde manier te beheersen8. Hiervoor is software geschreven met LabVIEW die de controle en bewaking van de temperatuur van een stromende reservoirdialyse-opstelling in contact met Peltier-elementen mogelijk maakt, via een elektronische controller en een koelmachine. Dezelfde software reguleert ook automatisch de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing (bijvoorbeeld de uitwisseling van kristallisatiemiddelen) met behulp van een multichannel vloeibaar systeem. Daarnaast worden een digitale camera en een omgekeerde microscoop gebruikt om het kristallisatieproces te visualiseren en vast te leggen. Twee kristallisatiekamers met volumes van 15 μL en 250 μL zijn beschikbaar voor het kweken van kristallen voor verschillende doeleinden. Omdat het kristallisatieproces omkeerbaar is, is screening op verschillende omstandigheden mogelijk met slechts een paar microliters van de eiwitoplossing zolang het monster niet wordt beschadigd8. Als gevolg hiervan minimaliseert het gebruik van deze methode de hoeveelheid eiwitmateriaal die wordt gebruikt.
Uit eerder werk8blijkt dat tijdens het kristalgroeiproces in situ observaties met regelmatige tijdsintervallen moeten worden uitgevoerd. Deze kunnen variëren van enkele seconden tot meerdere dagen, afhankelijk van de gebeurtenis onder observatie (neerslag, nucleatie of kristalgroei).
De optimalisatie van kristalgroei met OptiCrys is gebaseerd op temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen. In het geval van eiwitten met oplosbaarheid als directe functie van de temperatuur, is het mogelijk om gebruik te maken van het zoute regime18. Dit is waar het verhogen van de ionische sterkte van de oplossing, die kan worden gevisualiseerd met behulp van eiwitprecipitante fasediagrammen, de oplosbaarheid van het eiwit vermindert. Evenzo kunnen eiwitten met omgekeerde oplosbaarheid gebruik maken van het zoute regime18. Nucleatie vindt plaats in de nucleatiezone, in de buurt van de uitzaaibare zone, en kristalgroei vindt dan plaats in de uitzaaibare zone van het fasediagram totdat de eiwitconcentratie de oplosbaarheidsgrens bereikt. Zoals weergegeven in figuur 3A,kan met een constante chemische samenstellingstemperatuur worden verlaagd om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone te houden om nieuwe nucleatie te voorkomen. Kristallen groeien tot het tweede kristal/oplossingsevenwicht is bereikt en daarna wordt geen verdere toename van de grootte van kristallen waargenomen. De temperatuur wordt meerdere keren verlaagd totdat de kristallen de gewenste grootte hebben bereikt. In figuur 3Bhoudt het verhogen van de neerslagconcentratie bij constante temperatuur de oplossing in de uitzaaibare zone. Dit proces kan vervolgens meerdere keren worden herhaald om grote kristallen te verkrijgen. Het veranderen van de temperatuur en het manipuleren van de kristallisatieoplossingsomstandigheden, door de oververzadigingsniveaus te regelen, zijn twee krachtige hulpmiddelen voor het scheiden van nucleatie en groei van kristallen die nauwkeurig en automatisch worden gecontroleerd door OptiCrys5,8,14.
Voorbeelden van eiwitkristallen die worden gekweekt door temperatuurgecontroleerde, of temperatuur- en neerslagconcentratiegestuurde kristallisatie, evenals relatieve diffractiegegevens die zijn verkregen, zijn beschikbaar in de literatuur en PDB. Onder hen zijn menselijke γ-kristallijne E, PA-IIL lectine, gist anorganische pyrofosfatase, uraatoxidase, humaan koolzuuranhydrase II, YchB kinase en lactaatdehydrogenase5,14,17,18.
Hoewel OptiCrys werd gecommercialiseerd door NatX-ray, zijn er veel laboratoria die geen toegang hebben tot dit instrument of tot de seriële aanpak die het biedt. Het alternatief voor deze techniek is het gebruik van in de handel verkrijgbare plastic microdialyseknoppen met verschillende volumes. Hiermee kunnen temperatuur en chemische samenstelling handmatig worden aangepast en gevarieerd. Inspectie van microdialyseknoppen kan niet ter plaatse worden uitgevoerd en moet in plaats daarvan handmatig worden uitgevoerd met een optische microscoop. Temperatuurregeling kan worden bereikt door het monster in een trillingsvrije temperatuurgecontroleerde incubator te bewaren. Het is essentieel om de temperatuur constant te houden om ervoor te zorgen dat kristallisatie-experimenten reproduceerbaar zijn. Aanzienlijke temperatuurschommelingen kunnen ook leiden tot beschadiging of vernietiging van kristallen5.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol met een beschrijving van de monstervoorbereiding en het gebruik van besturingssoftware voor de groei van grote, hoogwaardige kristallen die geschikt zijn voor neutroneneiwitkristallografie. Deze stapsgewijze procedure is ontworpen om te profiteren van het kristallisatiefasediagram om een uitgangspositie en kinetisch pad te selecteren om de grootte en de kwaliteit van de gegenereerde kristallen te bepalen. Bovendien wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het kweken van kristallen met microdialyseknoppen, dat dezelfde redenering gebruikt om grote kristallen van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Verschillende fysische, chemische en biologische variabelen beïnvloeden de kristallisatie van eiwitten door de oplosbaarheid van eiwitten te beïnvloeden21. Onder deze variabelen worden hier temperatuur en chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing gebruikt in combinatie met dialysetechniek om grote hoogwaardige kristallen van biomacromolecules te verbeteren en te kweken voor neutronendiffractiestudies. Door gebruik te maken van kennis van fasediagrammen wordt kristallisatie voorspelbaarder gemaakt. Hoewel screening van verschillende kristallisatieomstandigheden in een seriële benadering ook mogelijk is, is het belangrijkste doel van het gebruik van de gepresenteerde rationele benaderingen het scheiden en beheersen van de kinetiek van kristalkernatie en groei.
Net als bij alle kristallisatiestudies verhogen pure en homogene eiwitmonsters van hoge kwaliteit en stofvrije kristallisatieoplossingen het slagingspercentage van het experiment. Filtratie en centrifugeren van oplossingen zijn essentiële stappen in de beschreven protocollen. Het kennen van de fysisch-chemische eigenschappen van de bestudeerde eiwitten, zoals het molecuulgewicht (om het juiste dialysemembraan te kiezen), het iso-elektrische punt en de oplosbaarheid van eiwitten zijn cruciaal voor het ontwerp van een optimaal kristalgroeiexperiment. Ook moet rekening worden gehouden met eiwitstabiliteit bij verschillende temperaturen of met verschillende chemicaliën om monsterverlies te voorkomen en de kans op succes te vergroten. Gezien het temperatuurbereik van OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), kan een breed scala aan eiwitten ermee worden gekristalliseerd. Maar het is de moeite waard om te benadrukken dat eiwitten die voornamelijk thermostabieel zijn, zoals eiwitten uit thermofiele bronnen, het meest zouden profiteren van temperatuurgecontroleerde kristalgroeiexperimenten met een groot volume die door dit instrument worden aangeboden.
Met behulp van een dialysekamer met een laag volume (bij gebruik van OptiCrys) of microdialyseknoppen en het screenen van verschillende temperaturen en kristallisatieomstandigheden (bijv. rasters van neerslagconcentratie of pH), is het mogelijk om informatie te verkrijgen over de locatie van de grenswaarde van de uitzaaibare zone (kinetisch evenwicht tussen nucleatie en uitzaaibare zones). Dit is van onschatbare waarde bij het ontwerpen van een succesvol kristalgroeiexperiment, vooral voor nieuwe eiwitkandidaten in kristallisatie. Zonder deze informatie kunnen experimenten beginnen vanuit een gebied van het fasediagram met een hoge oververzadiging, te ver van de grens van de uitzaaibare zone om kristalkernatie gemakkelijk te beheersen. Hoewel de ontbinding van het eiwitprecipitaat kan worden geprobeerd, bijvoorbeeld door de temperatuur te verhogen in het geval van directe oplosbaarheid, voor eiwitten met verminderde thermostabiliteit, kan het langer op hoge temperatuur houden van het monster de eiwitprecipitatie onomkeerbaar maken. De beste strategie bestaat dus uit het gebruik van een eerste voorwaarde met lagere oververzadiging in de buurt van de grens van metastabiliteit, waar nucleatie kan worden gecontroleerd en eiwitneerslag kan worden vermeden. In lijn hiermee vermindert kristallisatievoorscreening de kans op een eiwitprecipitaat in de dialysekamer en verhoogt het de slagingssnelheid van het experiment.
Na het ontwerpen van een experiment is het voorbereiden van dialysekamers (OptiCrys) of microdialyseknoppen een andere belangrijke stap. Het voorkomen van luchtbelvorming in de dialysekamer/knop verhoogt de kans op succesvolle kristallisatie, vooral wanneer kleine volumes worden gebruikt. De aanwezigheid van luchtbellen in de dialysekamer kan ook de kinetiek van het kristallisatieproces veranderen en de reproduceerbaarheid van het experiment verminderen (omdat het contactoppervlak tussen eiwitten en oplossingen is gewijzigd). Niet alleen eiwit, maar ook kristallisatieoplossing kan het succes van het experiment beïnvloeden. Het gebruik van nieuwe buizen van 50 ml voor het pompsysteem telkens wanneer men na elk experiment een nieuw experiment wil starten en wasslangen na elk experiment vermindert de kans op besmetting en vermijdt de creatie van zoutkristallen in het apparaat.
Het gebruik van microdialyseknoppen is een alternatief wanneer OptiCrys niet beschikbaar is. De hierboven genoemde strategieën voor het optimaliseren van kristallisatie en het monitoren van kristalgroei moeten handmatig worden uitgevoerd. Meestal vereist dit dat u zich buiten een thermogereguleerde incubator bevindt, wat problematisch kan zijn wanneer temperatuurregulatie een kritieke stap is in de beschreven methodologie. Dit vergemakkelijkt niet het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossingen, of het monitoren van kristalgroei door beeldvorming, zodat het kristalgroeiproces niet in realtime kan worden gecontroleerd.
Kennis van het fasediagram is de basis van het gebruik van de kristallisatiebank, OptiCrys, om systematisch grote, hoogwaardige kristallen op een geautomatiseerde manier te laten groeien. Controle van fysisch-chemische parameters zoals temperatuur, neerslagconcentratie en pH tijdens kristallisatie verplaatst het eiwit-oplossingsevenwicht in een goed gedefinieerd kinetisch traject over het fasediagram. Dit wordt aangevuld met het gebruik van een dialysemembraan om het massatransport aan te passen en een gecontroleerde gradiënt in de kristallisatiekamer te creëren die de grootte en kwaliteit van de kristallen beïnvloedt. Daarom is het gebruik van zowel thermodynamische gegevens als kinetische trajecten essentieel om het kristallisatieproces te beheersen om kristallen van hoge kwaliteit te laten groeien. Dankzij OptiCrys kunnen systematische fasediagrammen in een multidimensionale ruimte worden bestudeerd met een seriële benadering met aanzienlijk minder materiaal dan voorheen. Om deze methodologie aan te tonen, bieden we hier een casestudy met een modeleiwit, kippeneiwit lysozym. Door het hier gepresenteerde protocol te gebruiken en onder de knie te krijgen, kan men het aanpassen voor echte eiwitsystemen5,14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
MBS erkent de steun van de LABEX VALO GRAL in het kader van het contract 2015. NJ erkent CEA’s International Doctoral Research Program (Irtelis) voor de PhD Fellowship. Auteurs erkennen financiering uit het Horizon 2020 Research and Innovation Program van de Europese Unie in het kader van Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nummer 722687. Auteurs zijn dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) en dr. Jean-Luc Ferrer (PDS, Grenoble) ook dankbaar voor nuttige gesprekken en inzichten. IBS erkent integratie in het Interdisciplinair Onderzoeksinstituut van Grenoble (IRIG, CEA).
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |