Estudos estruturais de biomacromolecules por cristalografia requerem cristais de alta qualidade. Aqui demonstramos um protocolo que pode ser usado pelo OptiCrys (um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório) e/ou botões de microdiálise para o crescimento de grandes cristais de alta qualidade com base no conhecimento do diagrama de fase de cristalização.
O uso da cristalografia macromolecular de nêutrons (NMX) está se expandindo rapidamente com a maioria das estruturas determinadas na última década graças à construção de novas linhas de vigas NMX e ao aumento da disponibilidade de software de refinamento de estrutura. No entanto, as fontes de nêutrons atualmente disponíveis para NMX são significativamente mais fracas do que fontes equivalentes para cristalografia de raios-X. Apesar dos avanços neste campo, cristais significativamente maiores sempre serão necessários para estudos de difração de nêutrons, particularmente com a tendência de estudar macromoléculas e complexos cada vez maiores. Melhorias adicionais nos métodos e instrumentação adequados ao cultivo de cristais maiores são, portanto, necessárias para o uso do NMX para expandir.
Neste trabalho, introduzimos estratégias racionais e um banco de crescimento cristalino (OptiCrys) desenvolvido em nosso laboratório que combina observação em tempo real através de uma câmera de vídeo montada em microscópio com controle automatizado preciso de soluções de cristalização (por exemplo, concentração precipitante, pH, aditivo, temperatura). Em seguida, demonstramos como esse controle da temperatura e da composição química facilita a busca por condições ideais de cristalização usando proteínas solúveis do modelo. O conhecimento completo do diagrama da fase de cristalização é crucial para a seleção da posição inicial e do caminho cinético para qualquer experimento de cristalização. Mostramos como uma abordagem racional pode controlar o tamanho e o número de cristais gerados com base no conhecimento de diagramas de fase multidimensional.
Compreender a relação estrutura-função das proteínas e o mecanismo das vias fisiológicas muitas vezes depende de conhecer as posições dos átomos de hidrogênio (H) e como a carga é transferida dentro de uma proteína1,2. Uma vez que os átomos de hidrogênio dispersam os raios-X fracamente, suas posições só podem ser determinadas com dados de difração de raios-X de alta resolução (>1 Å)3,4. Por outro lado, a cristalografia de nêutrons pode ser usada para obter uma posição precisa dos átomos de hidrogênio em macromoléculas biológicas como hidrogênio e deutério (H2, isótopo de hidrogênio) os átomos têm comprimentos de dispersão de magnitude aproximadamente igual como oxigênio, nitrogênio e carbono5. No entanto, o fluxo de nêutrons de fontes de nêutrons disponíveis é mais fraco que o dos feixes de raios-X, por isso isso deve ser compensado muitas vezes por2,3. Isso pode ser conseguido trocando H por H2 e/ou aumentando o volume de cristais para reduzir a dispersão incoerente de hidrogênios e aumentar a relação sinal-ruído de imagens de difração.
Existem várias abordagens de cristalização (o diagrama de fase esquemática correspondente é mostrado na Figura 1) para a obtenção de cristais de grande e alta qualidade tanto para a cristalografia biomolecular de raios-X quanto para o biomolecular de nêutrons6. Na difusão de vapor, uma gotícula preparada a partir de uma mistura de uma proteína e uma solução de cristalização é equilibrada ao longo do tempo, através da evaporação de água ou outras espécies voláteis, contra um reservatório contendo uma maior concentração de precipitante da mesma solução de cristalização. O aumento da concentração de proteína e precipitante na gotícula leva à supersaturação necessária para a nucleação espontânea, seguida pelo crescimento cristalino nesses núcleos6,7. Embora a difusão de vapor seja a técnica mais utilizada para o cultivo de cristais4,o processo de cristalização não pode ser precisamente controlado8. No método de difusão de interface livre, a solução de cristalização se divide em uma solução proteica concentrada, direcionando lentamente o sistema para a supersaturação. Este método pode ser considerado como um método de lote com uma taxa de mistura lenta6,9,10,11,12. No método do lote, a proteína é rapidamente misturada com uma solução de cristalização que leva à supersaturação rápida e, por sua vez, nucleação uniforme com muitos cristais3,7. Este método representa aproximadamente um terço de todas as estruturas atualmente depositadas no Protein Data Bank. O método de diálise também é usado para o cultivo de cristais proteicos de alta qualidade e bem difração. No método de diálise, moléculas de precipitantes difusam de um reservatório através de uma membrana semi-permeável em uma câmara separada com a solução proteica. A cinética do equilíbrio depende de vários fatores, como temperatura, tamanho dos poros de membrana, e o volume e concentração de amostras de proteínas e agentes de cristalização6.
Diagramas de fase de cristalização podem ser usados para descrever diferentes estados de uma proteína em função de diferentes variáveis físicas ou químicas3. Conforme ilustrado na Figura 1,cada técnica de cristalização pode ser visualizada como utilizando uma trajetória cinética diferente para alcançar a nucleação e zonas metastáveis de tal diagrama6,10,13. Isso fornece informações sobre a solubilidade da proteína e a concentração proteica na qual se observa um equilíbrio termodinâmico entre cristal e solução, encontrando assim as condições ideais para a nucleação e o crescimento3,14. Em um diagrama de fase bidimensional, a concentração proteica é traçada em função de uma variável e as outras variáveis são mantidas constantes15. Em tal diagrama de fase, quando a concentração proteica está abaixo da curva de solubilidade, a solução está na região subsaturada e não ocorre nucleação ou crescimento cristalino. Acima desta curva está a zona de supersaturação onde a concentração proteica é maior do que o limite de solubilidade3,14. Isso é ainda dividido em três regiões: a zona metastável, a zona de nucleação espontânea e a zona de precipitação. Na zona metastável, a supersaturação não é suficiente para que a nucleação ocorra dentro de um tempo razoável, mas o crescimento de cristais semeados pode ocorrer. A agregação e precipitação são favorecidas na zona de precipitação, onde a supersaturação é muito alta14,15.
Quando a supersaturação suficiente para a nucleação espontânea for alcançada, os primeiros núcleos aparecerão10. O crescimento dos cristais leva a uma redução na concentração proteica até que o limite de solubilidade seja atingido. Enquanto a supersaturação permanecer nas proximidades da curva de solubilidade, não haverá mudança significativa no tamanho dos cristais. No entanto, tem-se demonstrado que as variações na temperatura e na composição química da solução de cristalização (por exemplo, a concentração de precipitantes) afetarão a solubilidade proteica e podem levar ao início de um crescimento cristalino adicional8,13,16.
Como a diálise é vantajosa para o crescimento de cristal de boa qualidade, o banco de cristalização OptiCrys ilustrado na Figura 2,foi projetado e desenvolvido em nosso laboratório para controlar a cristalização de forma totalmente automatizada8. Para isso, foi escrito um software com o LabVIEW que permite o controle e o monitoramento da temperatura de uma instalação de diálise de reservatórios em contato com elementos Peltier, através de um controlador eletrônico e um refrigerador. O mesmo software também regula automaticamente a composição química da solução de cristalização (por exemplo, a troca de agentes de cristalização) utilizando um sistema fluido multicanal. Além disso, uma câmera digital e um microscópio invertido são usados para visualizar e registrar o processo de cristalização. Duas câmaras de cristalização com volumes de 15 μL e 250 μL estão disponíveis para o cultivo de cristais para diferentes propósitos. Como o processo de cristalização é reversível, a triagem para diferentes condições é possível com apenas alguns microliters da solução proteica, desde que a amostra não seja danificada8. Como resultado, o uso deste método minimiza a quantidade de material proteico utilizado.
A partir do trabalho anterior8,é evidente que durante o processo de crescimento do cristal, observações in situ precisam ser realizadas em intervalos de tempo regulares. Estes podem variar de alguns segundos a vários dias, dependendo do evento sob observação (precipitação, nucleação ou crescimento cristalino).
A otimização do crescimento de cristal com OptiCrys é baseada em diagramas de fase de concentração precipitantes de temperatura. No caso de proteínas com solubilidade como função direta da temperatura, é possível fazer uso do regime de salgadinho18. É aí que o aumento da força iônica da solução, que pode ser visualizada usando diagramas de fase proteica-precipitante, diminui a solubilidade da proteína. Da mesma forma, proteínas com solubilidade inversa podem fazer uso do regime de salgagem18. A nucleação ocorre na zona de nucleação, nas proximidades da zona metastável, e o crescimento cristalino ocorre então na zona metastável do diagrama de fase até que a concentração proteica atinja o limite de solubilidade. Como mostrado na Figura 3A,com temperatura constante de composição química pode ser diminuída para manter a solução de cristalização na zona metastável para evitar novas nucleações. Os cristais crescem até que o segundo equilíbrio cristal/solução seja alcançado e, depois disso, não se observa mais aumento no tamanho dos cristais. A temperatura é diminuída várias vezes até que os cristais atinjam o tamanho desejado. Na Figura 3B,em temperatura constante, o aumento da concentração precipitante mantém a solução na zona metastável. Este processo pode então ser repetido várias vezes para obter cristais grandes. Alterar a temperatura e manipular as condições da solução de cristalização, controlando os níveis de supersaturação, são duas ferramentas poderosas para separar a nucleação e o crescimento de cristais controlados com precisão e automaticamente pelo OptiCrys5,8,14.
Exemplos de cristais proteicos cultivados pela cristalização controlada pela temperatura, ou cristalização controlada pela temperatura e precipitação, bem como dados relativos de difração obtidos estão disponíveis na literatura e PDB. Entre eles estão γ-cristalina humana E, lectina PA-IIL, pirofosfatase inorgânica da levedura, oxidase útero, anidratose carbonic humana II, YchB quinasase e lactato desidrogenase5,14,17,18.
Embora o OptiCrys tenha sido comercializado pelo NatX-ray, existem muitos laboratórios que não têm acesso a este instrumento ou à abordagem serial que oferece. A alternativa para esta técnica é usar botões de microdiálise plástica disponíveis comercialmente com vários volumes. Utilizando estes, a temperatura e a composição química podem ser ajustadas e variadas manualmente. A inspeção de botões de microdiálise não pode ser feita in situ e deve ser feita manualmente com um microscópio óptico. O controle de temperatura pode ser alcançado mantendo a amostra em uma incubadora controlada pela temperatura livre de vibração. É essencial manter a temperatura constante para garantir que os experimentos de cristalização sejam reprodutíveis. Variação significativa na temperatura também pode levar a danos ou destruição de cristais5.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado descrevendo a preparação da amostra e o uso de software de controle para o crescimento de cristais grandes e de alta qualidade adequados para cristalografia de proteína de nêutrons. Este procedimento passo a passo foi projetado para aproveitar o diagrama de fase de cristalização, a fim de selecionar uma posição inicial e caminho cinético para controlar o tamanho e a qualidade dos cristais gerados. Além disso, é apresentado um protocolo detalhado para o cultivo de cristais com botões de microdiálise que usa a mesma lógica para obter cristais grandes e de alta qualidade.
Diferentes variáveis físicas, químicas e biológicas influenciam a cristalização proteica, afetando a solubilidade da proteína21. Entre essas variáveis, a temperatura e a composição química da solução de cristalização são utilizadas aqui em combinação com a técnica de diálise para melhorar e cultivar grandes cristais de alta qualidade de biomacromléculas para estudos de difração de nêutrons. Usando o conhecimento de diagramas de fase, a cristalização torna-se mais previsível. Embora a triagem de diferentes condições de cristalização em uma abordagem serial também seja possível, o principal objetivo do uso das abordagens racionais apresentadas é separar e controlar a cinética da nucleação e crescimento cristalino.
Semelhante a todos os estudos de cristalização, amostras de proteína pura e homogênea de alta qualidade e soluções de cristalização sem poeira aumentam a taxa de sucesso do experimento. Filtração e centrifugação de soluções são etapas essenciais nos protocolos descritos. Conhecendo as propriedades fisicoquímicas das proteínas estudadas, como o peso molecular (para escolher a membrana de diálise apropriada), o ponto isoelétrico e a solubilidade proteica são cruciais para o projeto de um experimento de crescimento cristalino ideal. Além disso, deve-se considerar a estabilidade da proteína em diferentes temperaturas ou com diferentes produtos químicos para evitar a perda de amostras e aumentar a probabilidade de sucesso. Considerando a faixa de temperatura do OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), uma ampla gama de proteínas pode ser cristalizada usando-a. Mas vale ressaltar que as proteínas que são principalmente termoestabilidade, como proteínas de fontes termofílicas, seriam as mais beneficiadas em experimentos de crescimento de cristais de grande volume controlados pela temperatura oferecidos por este instrumento.
Usando uma câmara de diálise de baixo volume (ao usar botões OptiCrys) ou microdiálise e triagem de várias temperaturas e condições de cristalização (por exemplo, grades de concentração precipitante ou pH), é possível obter informações sobre a localização do limite da zona metastável (equilíbrio cinético entre nucleação e zonas metastáveis). Isso é inestimável ao projetar um experimento de crescimento cristalino bem sucedido especialmente para novos candidatos a proteínas na cristalização. Sem essas informações, os experimentos podem começar a partir de uma área do diagrama de fase com alta supersaturação, muito longe do limite da zona metastável para controlar facilmente a nucleação cristalina. Embora a dissolução do precipitado proteico possa ser tentada, por exemplo, aumentando a temperatura no caso da solubilidade direta, para proteínas com termestabilidade reduzida, manter a amostra em alta temperatura por um período maior de tempo pode tornar a precipitação proteica irreversível. Assim, a melhor estratégia consiste em utilizar uma condição inicial com menor supersaturação localizada perto do limite de metaestabilidade, onde a nucleação pode ser controlada e a precipitação proteica evitada. Em consonância com isso, a cristalização pré-triagem diminui a chance de ter uma proteína precipitada na câmara de diálise e aumenta a taxa de sucesso do experimento.
Depois de projetar um experimento, preparar câmaras de diálise (OptiCrys) ou botões de microdiálise é outro passo importante. Impedir a formação de bolhas de ar na câmara/botão de diálise aumenta a chance de cristalização bem sucedida, especialmente quando pequenos volumes são usados. A presença de bolhas de ar na câmara de diálise também pode alterar a cinética do processo de cristalização e reduzir a reprodutibilidade do experimento (porque a superfície de contato proteína/solução foi modificada). Não só a solução de cristalização de proteínas, mas também a solução de cristalização pode afetar o sucesso do experimento. Usando novos tubos de 50 mL para o sistema de bombeamento cada vez que se quer iniciar um novo experimento e lavar tubos após cada experimento diminui a chance de contaminação e evita a criação de cristais de sal no aparelho.
O uso de botões de microdiálise é uma alternativa quando o OptiCrys não está disponível. As estratégias de otimização da cristalização e monitoramento do crescimento cristalino mencionados acima, devem ser realizadas manualmente. Normalmente, isso requer estar fora de uma incubadora termoregulada, o que pode ser problemático quando a regulação da temperatura é um passo crítico na metodologia descrita. Isso não facilita a alteração da composição química das soluções de cristalização, nem o monitoramento do crescimento de cristais por imagem, de modo que o processo de crescimento de cristais não pode ser controlado em tempo real.
O conhecimento do diagrama de fase é a base do uso do banco de cristalização, OptiCrys, para cultivar sistematicamente cristais grandes e de alta qualidade de forma automatizada. O controle de parâmetros físico-químicos como temperatura, concentração precipitante e pH durante a cristalização move o equilíbrio proteína-solução em uma trajetória cinética bem definida ao longo do diagrama de fase. Isso é complementado pelo uso de uma membrana de diálise para ajustar o transporte de massa e criar um gradiente controlado na câmara de cristalização que afeta o tamanho e a qualidade dos cristais. Portanto, o uso de dados termodinâmicos e trajetórias cinéticas é essencial para controlar o processo de cristalização para cultivar cristais de alta qualidade. Graças ao OptiCrys, diagramas de fase sistemáticas em um espaço multidimensional podem ser estudados com uma abordagem serial usando significativamente menos material do que antes. Para demonstrar essa metodologia, fornecemos aqui um estudo de caso com uma proteína modelo, a lise de ovo de galinha branca. Utilizando e dominando o protocolo aqui apresentado pode-se adaptá-lo para sistemas de proteínas reais5,14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
A MBS reconhece o suporte do LABEX VALO GRAL no âmbito do contrato 2015. NJ reconhece o Programa Internacional de Pesquisa de Doutorado (Irtelis) do CEA para a Bolsa de Doutorado. Os autores reconhecem o financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie número 722687. Os autores também são gratos ao Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) e ao Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) por conversas e insights úteis. O IBS reconhece a integração ao Instituto de Pesquisa Interdisciplinar de Grenoble (IRIG, CEA).
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |