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Biology

Optimisation de la croissance cristalline pour la cristallographie macromoléculaire neutronique

Published: March 13, 2021
doi:
10.3791/61685
, ,
1CEA, CNRS, IBS,Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

Les études structurelles des biomacromolecules par cristallographie nécessitent des cristaux de haute qualité. Ici, nous démontrons un protocole qui peut être utilisé par OptiCrys (un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire) et / ou boutons de microdialyse pour la croissance de gros cristaux de haute qualité basée sur la connaissance du diagramme de phase de cristallisation.

Abstract

L’utilisation de la cristallographie macromoléculaire neutronique (NMX) se développe rapidement avec la plupart des structures déterminées au cours de la dernière décennie grâce à la construction de nouvelles lignes de faisceauX NMX et à la disponibilité accrue de logiciels de raffinement de la structure. Cependant, les sources de neutrons actuellement disponibles pour NMX sont significativement plus faibles que les sources équivalentes pour la cristallographie aux rayons X. Malgré les progrès réalisés dans ce domaine, des cristaux beaucoup plus gros seront toujours nécessaires pour les études de diffraction neutronique, en particulier avec la tendance à étudier des macromolécules et des complexes de plus en plus grands. D’autres améliorations des méthodes et de l’instrumentation adaptées à la croissance de cristaux plus gros sont donc nécessaires à l’expansion de l’utilisation de NMX.

Dans ce travail, nous introduisons des stratégies rationnelles et un banc de croissance cristalline (OptiCrys) développé dans notre laboratoire qui combine l’observation en temps réel à l’aide d’une caméra vidéo montée au microscope avec un contrôle automatisé précis des solutions de cristallisation (p. ex., concentration de précipités, pH, additif, température). Nous démontrons ensuite comment ce contrôle de la température et de la composition chimique facilite la recherche de conditions de cristallisation optimales à l’aide de protéines solubles modèles. Une connaissance approfondie du diagramme de phase de cristallisation est cruciale pour choisir la position de départ et le chemin cinétique pour toute expérience de cristallisation. Nous montrons comment une approche rationnelle peut contrôler la taille et le nombre de cristaux générés en fonction de la connaissance des diagrammes de phase multidimensionnels.

Introduction

Comprendre la relation structure-fonction des protéines et le mécanisme des voies physiologiques repose souvent sur la connaissance des positions des atomes d’hydrogène (H) et sur la façon dont la charge est transférée dans uneprotéine 1,2. Puisque les atomes d’hydrogène dispersent faiblement les rayons X, leurs positions ne peuvent être déterminées qu’avec des données de diffraction des rayons X à très haute résolution (>1 Å)3,4. Inversement, la cristallographie neutronique peut être utilisée pour obtenir une position précise des atomes d’hydrogène dans les macromolécules biologiques, car les atomes d’hydrogène et de deutérium (H2,isotope de l’hydrogène) ont des longueurs de diffusion d’une magnitude à peu près égale à l’oxygène, à l’azote et aucarbone 5. Cependant, le flux neutronique provenant des sources de neutrons disponibles est plus faible que celui des faisceaux de rayons X, de sorte que cela doit souventêtre compensé pour 2,3. Ceci peut être réalisé en échangeant H avec H2 et/ou en augmentant le volume des cristaux pour réduire la diffusion incohérente des hydrogènes et augmenter le rapport signal-bruit des images de diffraction.

Il existe diverses approches de cristallisation (le diagramme de phase schématique correspondant est indiqué à la figure 1)pour l’obtention de cristaux de grande et de haute qualité pour la cristallographie biomoléculaire aux rayons X et aux neutrons6. Dans la diffusion de vapeur, une gouttelette préparée à partir d’un mélange d’une protéine et d’une solution de cristallisation est équilibrée au fil du temps, par évaporation de l’eau ou d’autres espèces volatiles, contre un réservoir contenant une concentration plus élevée de précipitation de la même solution de cristallisation. L’augmentation de la concentration de protéines et de précipitation dans la gouttelette conduit à la sursaturation nécessaire à la nucléation spontanée suivie d’une croissance cristalline à ces noyaux6,7. Bien que la diffusion de vapeur soit la technique la plus fréquemment utilisée pour la croissance descristaux 4,le processus de cristallisation ne peut pas être contrôléavec précision 8. Dans la méthode de diffusion de l’interface libre, la solution de cristallisation se diffuse en une solution protéique concentrée, orientant très lentement le système vers la sursaturation. Cette méthode peut être considérée comme une méthode de lot avec un taux de mélangelent 6,9,10,11,12. Dans la méthode de lot, la protéine est rapidement mélangée avec une solution de cristallisation menant à la sursaturation rapide et à son tour nucléation uniformeavec beaucoup de cristaux 3,7. Cette méthode représente environ un tiers de toutes les structures actuellement déposées dans la Banque de données sur les protéines. La méthode de dialyse est également utilisée pour la culture de cristaux protéiques de haute qualité et bien réfractaires. Dans la méthode de dialyse, les molécules de précipitation diffusent à partir d’un réservoir à travers une membrane semi-perméable dans une chambre séparée avec la solution protéique. La cinétique de l’équilibrage dépend de divers facteurs, tels que la température, la taille des pores membranaires et le volume et la concentration d’échantillons de protéines et d’agents de cristallisation6.

Les diagrammes de phase de cristallisation peuvent être utilisés pour décrire différents états d’une protéine en fonction de différentes variables physiques ouchimiques 3. Comme l’illustre la figure 1, chaque technique de cristallisation peut être visualisée comme utilisant une trajectoire cinétique différente pour atteindre la nucléation et les zones métastables d’un teldiagramme 6,10,13. Ceci fournit l’information au sujet de la solubilité de protéine et de la concentration de protéine à laquelle un équilibre thermodynamique entre le cristal et la solution est observé, trouvant de ce fait les conditions optimales pour la nucléationet la croissance 3,14. Dans un diagramme de phase bidimensionnel, la concentration en protéines est tracée en fonction d’une variable et les autres variables sont maintenues constantes15. Dans un tel diagramme de phase, lorsque la concentration de protéines est inférieure à la courbe de solubilité, la solution se trouve dans la région sous-saturée et aucune nucléation ou croissance cristalline ne se produit. Au-dessus de cette courbe se trouve la zone de sursaturation où la concentration en protéines est supérieure à la limite de solubilité3,14. Celui-ci est ensuite divisé en trois régions : la zone métastable, la zone de nucléation spontanée et la zone de précipitations. Dans la zone métastable, la sursaturation n’est pas suffisante pour que la nucléation se produise dans un délai raisonnable, mais la croissance des cristaux ensemencés peut avoir lieu. L’agrégation et les précipitations sont favorisées dans la zone de précipitations, où la sursaturationest trop élevée 14,15.

Lorsque la sursaturation suffisante pour la nucléation spontanée est atteinte, les premiers noyaux apparaîtront10. La croissance des cristaux conduit à une réduction de la concentration en protéines jusqu’à ce que la limite de solubilité soit atteinte. Tant que la sursaturation restera à proximité de la courbe de solubilité, il n’y aura pas de changement significatif dans la taille des cristaux. Cependant, il a été démontré que les variations de la température et de la composition chimique de la solution de cristallisation (par exemple, la concentration de précipitation) affecteront la solubilité protéique et peuvent conduire à l’initiation d’une croissancecristalline supplémentaire 8,13,16.

Comme la dialyse est avantageuse pour une croissance cristalline de bonne qualité, le banc de cristallisation OptiCrys illustré dans la figure 2, a été conçu et développé dans notre laboratoire pour contrôler la cristallisation d’une manièreentièrement automatisée 8. À cette fin, un logiciel a été écrit avec LabVIEW qui permet le contrôle et la surveillance de la température d’une installation de dialyse réservoir qui coule en contact avec les éléments Peltier, via un contrôleur électronique et un refroidisseur. Le même logiciel régule également automatiquement la composition chimique de la solution de cristallisation (par exemple l’échange d’agents de cristallisation) à l’aide d’un système fluidique multicanal. En outre, un appareil photo numérique et un microscope inversé sont utilisés pour visualiser et enregistrer le processus de cristallisation. Deux chambres de cristallisation de 15 μL et 250 volumes de μL sont disponibles pour la culture de cristaux à des fins différentes. Comme le processus de cristallisation est réversible, le criblage pour différentes conditions est possible avec seulement quelques microlitres de la solution protéique tant que l’échantillon n’est pasendommagé 8. Par conséquent, l’utilisation de cette méthode minimise la quantité de protéines utilisées.

D’après lestravaux antérieurs 8, il est évident que pendant le processus de croissance du cristal, des observations in situ doivent être effectuées à intervalles réguliers. Ceux-ci peuvent varier de quelques secondes à plusieurs jours, selon l’événement en observation (précipitations, nucléation ou croissance cristalline).

L’optimisation de la croissance du cristal avec OptiCrys est basée sur des diagrammes de phase de concentration de précipitation de température. Dans le cas des protéines dont la solubilité est une fonction directe de la température, il est possible d’utiliser le régime de salage18. C’est là que l’augmentation de la force ionique de la solution, qui peut être visualisée à l’aide de diagrammes de phase protéique-précipitant, diminue la solubilité de la protéine. De même, les protéines avec la solubilité inverse peuvent faire usage du régime de salage-dans18. La nucléation se produit dans la zone de nucléation, à proximité de la zone métastable, et la croissance du cristal a alors lieu dans la zone métastable du diagramme de phase jusqu’à ce que la concentration protéique atteigne la limite de solubilité. Comme le montre la figure 3A, avec une température de composition chimique constante peut être diminuée pour maintenir la solution de cristallisation dans la zone métastable pour empêcher la nouvelle nucléation. Les cristaux poussent jusqu’à ce que le deuxième équilibre cristal/solution soit atteint et après cela, aucune autre augmentation de la taille des cristaux n’est observée. La température est diminuée plusieurs fois jusqu’à ce que les cristaux atteignent la taille désirée. Dans la figure 3B,à température constante, l’augmentation de la concentration de précipitation maintient la solution dans la zone métastable. Ce processus peut ensuite être répété plusieurs fois pour obtenir de gros cristaux. Changer la température et manipuler les conditions de la solution de cristallisation, en contrôlant les niveaux de sursaturation, sont deux outils puissants pour séparer la nucléation et la croissance des cristaux qui sont contrôlés précisément et automatiquement par OptiCrys5,8,14.

Des exemples de cristaux protéiques cultivés par cristallisation contrôlée par la température, ou à température et précipitation contrôlée par concentration, ainsi que des données relatives de diffraction obtenues sont disponibles dans la littérature et la PDB. Parmi eux se trouvent la γ-crystalline E humaine, la lectine PA-IIL, la pyrophosphatase inorganique de levure, l’oxidase urate, l’anhydrase carbonique humaine II, la kinase YchB et la déshydrogénase lactate5,14,17,18.

Bien qu’OptiCrys ait été commercialisé par NatX-ray, il existe de nombreux laboratoires qui n’ont pas accès à cet instrument ou à l’approche sérielle qu’il offre. L’alternative à cette technique est d’utiliser des boutons de microdialyse plastique disponibles dans le commerce avec différents volumes. En utilisant ceux-ci, la température et la composition chimique peuvent être ajustées et variées manuellement. L’inspection des boutons de microdialyse ne peut se faire in situ et doit plutôt se faire manuellement au microscope optique. Le contrôle de la température peut être réalisé en gardant l’échantillon dans un incubateur à température contrôlée sans vibrations. Il est essentiel de maintenir la température constante pour s’assurer que les expériences de cristallisation sont reproductibles. Des variations significatives de température peuvent également entraîner des dommages ou la destruction des cristaux5.

Nous fournissons ici un protocole détaillé décrivant la préparation des échantillons et l’utilisation d’un logiciel de contrôle pour la croissance de gros cristaux de haute qualité adaptés à la cristallographie des protéines neutroniques. Cette procédure étape par étape a été conçue pour tirer parti du diagramme de phase de cristallisation afin de sélectionner une position de départ et un chemin cinétique pour contrôler la taille et la qualité des cristaux générés. En outre, un protocole détaillé pour la culture des cristaux avec des boutons de microdialyse est présenté qui utilise la même justification pour obtenir de grands cristaux de haute qualité.

Protocol

1. Méthode de dialyse avec boutons de microdialyse Préparation de l’échantillon Préparer la solution protéique en dissolvant 30 mg de lysozyme blanc d’œuf de poulet sous forme de poudre lyophilisée dans 1 mL de tampon COONa CH3(100 mM d’acétate de sodium, pH 4) afin d’obtenir une solution avec une concentration finale de 30 mg·mL-1. Centrifugeuse l’échantillon à la 13.000 × g pendant 10 min à 277 K. Ce processus permet d’éliminer les agrégats avant de commencer le processus de cristallisation. Vérifiez l’absorption de l’échantillon à 280 nm et calculez la concentration en protéines en utilisant l’équation Beer-Lambert (A= εcl).REMARQUE : Selon l’équation Beer-Lambert, l’absorption électronique (A) est directement proportionnelle à la concentration (c, mg·mL-1)d’une espèce absorbante étant donné une trajectoire optique constante (l, cm). Le gradient de cette relation linéaire est le coefficient d’extinction molaire (ε, pour le lysozyme à 280 nm est de 2,64 mL·mg−1·cm−1)19. Les sidechains des acides aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane et phénylalanine) et des liaisons de disulfide entre les résidus de cystéine ont une forte absorption à ~280 nm résultant de transitions spectroscopiquement autorisées par π – π*. Comme la majorité des protéines contiennent ces résidus, la concentration en protéines peut généralement être calculée facilement en mesurant l’absorption à 280 nm, compte tenu de la connaissance du coefficient d’extinction. Préparez des solutions de cristallisation comme le montre la figure 4. Filtrez toutes les solutions de stock avec des filtres Millipore de 0,22 μm avant de préparer la solution de cristallisation. Croissance cristalline Couper une membrane de dialyse à la cellulose avec coupure de poids moléculaire appropriée (6-8 kDa) et la tremper dans de l’eau distillée.REMARQUE : Les disques membranaires de dialyse sont disponibles dans le commerce pour les boutons de microdialyse, mais si le tube de dialyse est utilisé, n’oubliez pas de couper les bords afin de séparer les deux couches de membrane du tube pour n’avoir que des membranes à couche unique. Remplissez les puits d’un plateau de 24 puits avec 2 mL de solution de cristallisation dans le même ordre que indiqué dans la figure 4.REMARQUE : Si des boutons avec des volumes plus importants sont utilisés (p. ex., 200 μL), remplissez les tubes de 50 mL d’une solution de cristallisation d’au moins 5 mL afin d’assurer un échange efficace. Ajouter/Pipette 35 μL de solution lysozyme à la chambre du bouton de microdialyse illustrée dans la figure 5A.REMARQUE : Pour éviter la formation de bulles d’air dans un bouton de dialyse de 30 μL lorsqu’il est fermé, un volume supplémentaire (volume mort) de 5 μL de protéines supplémentaires doit être ajouté, ce qui signifie un total de 35 μL d’échantillon de protéines. Cet échantillon de protéines supplémentaire crée une forme légèrement bombée sur le dessus de la chambre, comme le montre la figure 5B, ce qui empêche la formation de bulles d’air. Prenez un applicateur de la taille appropriée et placez l’anneau élastique O à son extrémité (figure 5C). Placez ensuite la membrane, préalablement légèrement essuyée/drainée à l’aide d’un morceau de papier sans fibres, sur le dessus de la chambre du bouton de dialyse. Veillez à ne pas mettre de poussière dans la chambre lors de l’application du papier. Mettre la membrane de dialyse en place en transférant l’anneau O élastique de l’applicateur à la rainure du bouton de dialyse (Figure 5C).REMARQUE : Le moment critique de la manipulation est la fixation de la membrane de dialyse au-dessus de la chambre en transférant l’anneau élastique O de l’applicateur dans la rainure du bouton de dialyse. Tous les mouvements doivent être parfaitement synchronisés pour éviter d’enfermer les bulles d’air avec l’échantillon dans la chambre protéique. Il est utile de pratiquer l’étirement de l’anneau O élastique avant son application pour connaître sa rigidité, utiliser des pinces à épiler pour tenir une partie de la membrane pendant son application et effectuer les premières expériences d’essai avec une protéine modèle. Transférez le bouton au puits ou au tube de 50 mL à l’aide d’une pince à épiler(figure 5D). Couvrir le puits d’un coverslip, en appuyant doucement sur la graisse pour sceller le puits (Figure 5E).REMARQUE : S’il n’y a pas de graisse sur le dessus des puits, assurez-vous d’ajouter ceci avant de commencer l’expérience ou d’utiliser un morceau de ruban adhésif au lieu d’un couvercle en verre. Le principe de cristallisation des protéines à l’aide de boutons de microdialyse est illustré dans la figure 5. Gardez l’échantillon à 293 K dans un incubateur thermoréguléré. Différentes températures peuvent être nécessaires en fonction des conditions de protéines et de cristallisation utilisées.REMARQUE : La même grille de conditions de cristallisation indiquée à la figure 4 (permettant de varier la concentration de précipitation) peut être filtrée en fonction de la température. Dans un tel cas, la même plaque de cristallisation doit être reproduite et chaque copie doit être placée dans un incubateur réglé à une température différente. Cela nécessite la mise à disposition de plusieurs incubateurs thermorégulérés sans vibrations. Vérifiez le plateau ou les tubes pour les cristaux (Figure 4) et prendre des notes sur une base régulière, généralement tous les jours, pour distinguer ce qui est dans chaque plateau. De bonnes notes sont essentielles pour éviter les faux résultats positifs et discriminer la poussière des cristaux. 2. Processus de croissance cristalline à l’aide d’OptiCrys Préparation de l’échantillon Préparez une solution protéique et une membrane de dialyse décrites à la section 1.1. Préparez des solutions de stock de NaCl (4 M) et de CH3COONa pH 4 (1 M) et filtrez-les en tubes de 50 mL. Ajouter la solution protéique (15 μL de lysozyme avec 30 mg·mL-1)à la chambre de dialyse de la configuration de dialyse du réservoir à écoulement à température contrôlée. Consultez la figure 6 pour plus de détails sur la configuration de dialyse du réservoir à débit contrôlé par la température. OptiCrys a deux chambres de dialyse, le volume minimum est de 15 μL et le volume maximum est de 250 μL. Couvrez la surchamber d’une membrane de dialyse et fixez la membrane avec l’anneau élastique O(figure 6B).REMARQUE : Cette configuration est différente des boutons de microdialyse où chaque chambre est scellée directement par une membrane de dialyse. Dans la cellule d’écoulement, la membrane de dialyse est plutôt fixée à la surchamber permettant le montage des cristaux sans son enlèvement. À cette fin, la surchamber peut simplement être dévissé du réservoir. Retournez la chambre et placez-la sur la chambre de dialyse. Pressez lentement et doucement pour enlever tout l’air emprisonné entre les deux morceaux et éviter les bulles dans la chambre (Figure 6C). Pratiquer avec une protéine modèle peut être avantageux lors de l’entraînement pour éviter les bulles d’air et la perte d’échantillon. Fixez le réservoir dans sa position en le vissant doucement sur le dessus de la chambre à coucher, en étant de nouveau conscient d’éviter de piéger les bulles d’air. Un serrage excessif du réservoir peut également former des bulles dans la chambre de cristallisation( figure 6D). Ajouter la solution de cristallisation et couvrir la chambre du réservoir avec le bouchon hermétique. (Figure 6G). Le volume maximal du réservoir est de 1 mL. Transférez cet assemblage et insérez-le dans le support en laiton. Ce support est en contact avec les éléments Peltier qui sont utilisés pour contrôler la température. Comme l’illustre la figure 6,le bouchon hermétique est équipé d’une fenêtre optique pour permettre l’éclairage supérieur de la chambre de dialyse. Placez la source de lumière( figure 2) sur la fenêtre permettant à la lumière de passer à travers la chambre. La chambre du réservoir peut être reliée à une pompe pour lui permettre de fonctionner comme une cellule d’écoulement continu. Connectez le tube sur les tubes de 50 mL qui contiennent les solutions de stock et l’eau distillée à la valve rotative comme l’illustre la figure 7.REMARQUE : Si la préparation automatique et le changement des solutions de cristallisation ne sont pas souhaités pendant l’expérience, omettez l’étape 2.1.10. Dans un tel cas, la solution de cristallisation doit être préparée et le réservoir pré-rempli manuellement. Logiciel Allumez l’ordinateur et lancez le logiciel Croissance cristalline [Croissance cristalline]. Ce logiciel de contrôle est écrit avec LabVIEW(http://www.ni.com/labview/)et offre une interface graphique conviviale. Il comprend 4 interfaces graphiques différentes (Accueil [Bienvenue], Paramétrage [Réglage], Essai [Test], et Maintenance [Maintenance]) (Figure 8).REMARQUE : Les traductions de Français sont entre parenthèses. Sélectionnez la vue Maintenance en cliquant sur le bouton illustré dans la figure 8. Cette vue est actuellement la plus souvent utilisée et permet aux utilisateurs de contrôler la majorité des paramètres pendant l’expérience.REMARQUE : Après avoir cliqué sur la vue Maintenance, une nouvelle fenêtre avec différentes sections pour contrôler des paramètres tels que la température ou la lumière apparaîtra. Dans la figure 8, différentes parties de cette vue sont affichées avec des flèches et des cadres. Dans les étapes suivantes, nous démontrons comment chaque paramètre est contrôlé à l’aide du logiciel. La section Régulateur de température permet le contrôle et la surveillance de la température. Cliquez sur le bouton, numéro un (1) de la figure 8,pour l’allumer.REMARQUE : La plage de température à OptiCrys est de 233,0 à 353,0 ± 0,1 K. Réglez la température sur la section consigne [setpoint] et appuyez sur entrez( Figure 8(2)). Au-dessous de ce bouton, il y a un graphique avec 2 traces (rouge et jaune). La trace rouge indique la température finale (ordonnée) et la trace jaune indique la température actuelle. Comme le montre la figure 8(2),la température est fixée à 20 °C.REMARQUE : Pour faire pousser un cristal, comme expliqué dans la section de croissance du cristal, de nombreuses températures devront être choisies. Pour modifier la température, ajoutez chaque nouvelle température dans la section consigne [setpoint] et appuyez sur le bouton Entrez sur le clavier. Allumez la lumière en augmentant la luminosité de la section Lumières dans la figure 8. La luminosité varie de 0 à 100, « 0 » indique que la lumière est éteinte et à « 100 » la lumière est réglée au maximum de l’intensité et la luminosité. En augmentant la lumière, dans la section Microscope, on peut voir à l’intérieur de la chambre de dialyse. Pendant l’expérience, la luminosité de la cellule peut varier; ajuster les paramètres pour visualiser clairement à l’intérieur de la chambre de dialyse. Le grossissement peut également être augmenté ou diminué en utilisant les boutons + et – en face de « zoom » pour une meilleure visualisation. Sur le côté droit de la section Microscope, il y a plusieurs sections pour stocker des informations pertinentes pour chaque expérience de cristallisation. Chaque utilisateur peut créer un dossier pour stocker des informations sur les conditions de cristallisation, les noms des protéines et le seuil de poids moléculaire de la membrane de dialyse utilisée (Figure 8(3)). L’utilisateur peut définir un nom pour l’expérience en le tapant simplement sur le Dossier Nom [Nom du dossier]. En cliquant sur le dossier [bouton Dossier] (affiché avec un cadre vert dans la figure 8)ouvre une nouvelle fenêtre. Dans cette fenêtre, il y aura un fichier texte qui contient toutes les informations définies pour l’expérience. En outre, les images horodatées sont enregistrées dans ce dossier pour un traitement futur. À partir de la section Images duNouveau-Brunswick, sélectionnez le nombre d’images qui doivent être prises au cours de l’expérience. Spécifiez le nombre d’images dans le panneau de droite ainsi que l’intervalle de temps souhaité entre celles-ci (p. ex., min, heure, jour). La figure 8 montre la configuration du logiciel pour enregistrer zéro image en une minute.REMARQUE : Utilisez la section Pompe [Pompe] pour mélanger les solutions de stock et injecter une solution de cristallisation dans la chambre du réservoir. Consultez les sections 2.1.10 et 7 pour obtenir une explication du principe du système de mélange des fluides. Concentrations d’intrants des solutions stock dans Etape 1 [Étape 1]: stocks de solutions. Pour l’expérience de cristallisation dans la section suivante, NaCl 4 M et CH3COONa 1 M pH 4 seront utilisés.REMARQUE : Les concentrations de solutions de stock se font en unités molaire. Définissez la concentration finale de chaque solution. Par exemple 0,75 M pour nacl et 0,1 M pour CH3COONa pH 4. Entrez-les dans la section de concentration finale (Figure 8) dans l’Etape 2 [Étape 2]: solution à préparer. Appuyez sur le bouton Calcul [Calcul], qui est affiché avec un cadre rouge dans la figure 8. Le volume final de chaque solution de stock qui sera utilisé dans le mélange s’affichera dans le panneau de volume devant chaque panneau de concentration. Appuyez sur le bouton Lancer préparation [Préparation de lancement] ( Figure8). Comme l’illustre la figure 7,la valve rotative prend chaque solution de stock et les injecte au tube de mélange via un interrupteur. Une fois la solution de cristallisation préparée, cliquez sur le bouton Entrée solution [Entrée de solution] dans Etape 3 [Étape 3]: Flux de la section pompe (cadre jaune dans la figure 8). Le commutateur change pour injecter la nouvelle solution de cristallisation du tube de mélange dans la chambre du réservoir. Pour arrêter le processus d’échange, appuyez sur le bouton De distribution Arrêt [Arrêt de distribution].REMARQUE : Observez le processus de cristallisation pendant l’expérience et modifiez des paramètres tels que la température, la solution de cristallisation et le zoom, dans l’interface graphique correspondante du logiciel de supervision. En utilisant le logiciel, il n’est pas nécessaire de supprimer le bouchon hermétique ou la cellule d’écoulement pendant l’expérience de sorte que la seule variable sera celle que l’utilisateur change à travers le logiciel. Grande croissance cristalline Ajouter 15 μL de lysozyme avec une concentration de 30 mg·mL-1 à la chambre de dialyse (Figure 6A).REMARQUE : Préparez l’échantillon de protéines tel que décrit à la section 1.1. Assembler la configuration de dialyse du réservoir à débit contrôlé par la température décrite dans la section 2.1 et la figure 6. Préparez la solution de cristallisation. N’oubliez pas de filtrer toutes les solutions de stock avant la préparation de l’échantillon avec des filtres de 0,22 μm. Pour cette expérience, la solution de cristallisation contient 0,75 M NaCl et 0,1 M CH3COONa pH 4. Cela peut être ajouté manuellement ou en utilisant la chambre du réservoir et le système de pompage tel que décrit dans les sections 2.2.10 à 2.2.12. Réglez la température à 295 K comme expliqué dans les sections 2.2.3 et 2.2.4 et montré dans l’image 8. Dans les conditions initiales, l’équilibre entre la chambre de dialyse et le réservoir sera atteint après environ 90 minutes et les premiers noyaux visibles apparaîtront après 22 heures. Laisser pousser les cristaux jusqu’à ce qu’aucun changement plus visible de la taille des cristaux ne soit observé (figure 9, panneau 1).REMARQUE : Afin de déterminer le temps de nucléation et de mesurer la variation de la taille des cristaux, enregistrez des images toutes les 15 ou 20 minutes, soit respectivement 4 ou 3 images par heure dans la section Images du Nouveau-Brunswick. Pour l’observation in situ de la dénaturation des protéines, de l’agrégation et des précipitations ou de la dissolution ou de la nucléation des cristaux, il faut généralement entre quelques secondes et quelques dizaines de minutes. Toutefois, pour la croissance du cristal, cette plage se situe entre quelques minutes et quelques heures. Après trois jours, baisser la température à 291 K pour relancer la croissance du cristal. Maintenez la température constante et laissez le cristal se développer( figure 9, panneau 2). Pour cette étape de l’expérience, il suffira d’enregistrer des images toutes les 2 heures et de vérifier toutes les 10 à 12 heures tout changement dans la taille des cristaux. L’expérience peut être poursuivie si aucun changement dans la taille des cristaux n’est observé.REMARQUE : Selon les concentrations de protéines et de précipités dans la solution de cristallisation et les volumes de protéines utilisés, le temps nécessaire pour atteindre l’équilibre pour chaque étape peut varier. Diminuer la température à 288 K pour relancer la croissance du cristal. Dans l’état expérimental du cas présenté ici, un jour suffit pour atteindre l’équilibre(figure 9, panneau 3). Vérifiez la taille des cristaux et maintenez une température constante tant que le cristal continue de croître. Après 4 jours, réduire la température à 275 K afin de relancer la croissance du cristal(figure 9, panneau 4).– Dans les conditions expérimentales du cas présenté, après environ 10 jours, un cristal de 500 μm dans une dimension sera obtenu (Figure 9). Contrôle de la taille du cristal Préparez une solution protéique et la dialyse du réservoir à écoulement à température contrôlée, telle que décrite dans les sections 2.3.1 et 2.3.2. Préparez des solutions de cristallisation avec 0,9 M NaCl et 0,1 M CH3COONa pH 4. Réglez la température à 291 K et laissez pousser les cristaux. Dans des conditions initiales, le premier événement de nucléation commencera après environ une heure et de nombreux cristaux pousseront dans la chambre de dialyse pendant trois heures(figure 10, étapes : 1 et 2). Enregistrez des images toutes les 20 minutes pour vérifier la taille des cristaux pendant le processus de croissance.REMARQUE : L’optimisation des conditions de cristallisation est cruciale pour contrôler la plupart des propriétés finales des cristaux générés. La température et la composition chimique des solutions de cristallisation peuvent être modifiées pour dissoudre et repousser des cristaux de taille uniforme. Il convient également de noter qu’un échantillon de protéines n’est pas consommé dans une telle expérience, car les conditions peuvent être inversées pour dissoudre à nouveau l’échantillon tant qu’il n’est pas dénaturé. Lors de la dissolution des cristaux en changeant la température et en maintenant une composition chimique constante, continuez l’expérience comme suit : Une fois que les cristaux ont poussé à 291 K, ceux-ci peuvent être dissous pour repousser moins de cristaux plus gros. Augmentez graduellement la température de plus de 20 min pour atteindre 313 K. Il faut environ une heure pour dissoudre tous les cristaux à l’intérieur de la chambre de dialyse (Figure 10, étapes: 3-5). Enregistrez des images toutes les 5 à 15 minutes pour surveiller le processus de dissolution.REMARQUE : De nombreuses protéines sont sensibles aux températures élevées. Assurez-vous de travailler dans la plage de température où la protéine est stable pour éviter tout dommage / dénaturation. En plus de la solubilité protéique, la température affecte également la solution tampon. Par exemple, le pH du tampon peut changer avec la température, en particulier dans le tampon Tris. Dans un tel cas, il est crucial de régler le pH en fonction de la température à laquelle l’expérience est effectuée18. Il convient également de noter que la dissolution des protéines prend beaucoup moins de temps (de quelques minutes à quelques heures) par rapport à la croissance du cristal protéique (de quelques heures à quelques jours). En général, lors de la dissolution des cristaux, la température augmente progressivement et lentement (en respectant le court temps de dissolution totale), principalement en cas de dissolution partielle des cristaux pour éviter l’augmentation de la mosaïque cristalline. Lorsque les cristaux poussent, la température peut diminuer rapidement (en moins d’une minute) à la température définie (en respectant le temps de croissance total long). Une surveillance régulière de la chambre de cristallisation en enregistrant des images est conseillée pour prévenir les dommages à la protéine et aider à définir le moment optimal pour la dissolution ou la croissance des cristaux pour chaque protéine étudiée. Une fois que tous les cristaux se sont dissous, réglez la température à 295 K pour déclencher un deuxième événement de nucléation(figure 10, étapes : 6,7). Enregistrez des images toutes les 5 minutes pour surveiller le deuxième processus de nucléation. Dans cette étape, les premiers noyaux apparaissent après environ 18 minutes.REMARQUE : À cette température, la solution se trouvera dans la zone de nucléation, à proximité de la zone métastable. Par conséquent, seuls quelques noyaux apparaîtront dans la chambre de cristallisation. Poursuivre l’expérience en répétant le flux de travail d’optimisation décrit dans la section 2.3 pour la croissance de cristaux plus gros. La durée totale de l’expérience représentée à la figure 10 n’est que de quelques jours.REMARQUE : Si pendant la phase de nucléation les cristaux apparaissent à des moments différents, des cristaux de différentes tailles sont obtenus dans la chambre de cristallisation. Dans un tel cas, l’augmentation de la température (dans le cas des protéines à solubilité directe) entraînera une dissolution plus rapide des petits cristaux. Selon l’effet de maturation cinétique, la protéine supplémentaire (obtenue à partir de la dissolution) peut alors être utilisée pour la croissance des cristaux plus gros.Lors de la dissolution des cristaux à température constante en modifiant la composition chimique de la solution de cristallisation, continuez l’expérience comme suit :Il est également possible de dissoudre les cristaux cultivés précédemment en modifiant la composition chimique de la solution de cristallisation au cours de l’expérience pour repousser une population de cristaux de taille uniforme dans de nouvelles conditions. Préparez la solution protéique (2,3,1), la configuration de dialyse du réservoir à écoulement à température contrôlée (2,1) et la solution de cristallisation (2,4,2) décrite ci-dessus. Dans des conditions initiales dans la zone de nucléation loin de la zone métastable, de nombreux petits cristaux apparaîtront dans la chambre de cristallisation et commenceront à croître(figure 11, étapes : 1,2). Au bout de trois heures, lorsque de nombreux cristaux de taille moyenne sont visibles dans la chambre de cristallisation(figure 11,étape : 3), diminuez graduellement la concentration de NaCl (0,9 M) pour atteindre zéro. Pour cela, préparez une nouvelle solution de cristallisation contenant uniquement une solution tampon avec 0,1 M CH3COONa pH 4. Utilisez le système de pompage pour l’échanger avec la solution de cristallisation dans la chambre du réservoir. Suivez les étapes 2.2.10 à 2.2.12 pour la préparation et l’injection d’une nouvelle solution dans la chambre du réservoir. Avec cette nouvelle solution, lorsque des solutions sont échangées, la concentration de NaCl diminue dans la chambre jusqu’à ce que la solution finale dans la chambre réservoir ne contienne pas plus de 0,1 M de CH3COONa pH 4 et pas de NaCl. Capturez des images toutes les 10 minutes pour enregistrer le processus de dissolution. Permettre aux cristaux de se dissoudre complètement (Figure 11, étapes: 4,5). Le temps de dissolution est d’environ deux heures pour cette expérience. Comme mentionné précédemment, le temps de dissolution dépend du système protéique, des conditions de cristallisation et du volume de chambre de dialyse utilisé. L’observation régulière de la chambre de cristallisation (voir section Microscope) et l’enregistrement d’images et de notes pendant l’expérience sont essentiels. Lorsque tous les cristaux à l’intérieur de la chambre sont dissous(figure 11, étape : 5), utilisez à nouveau le système de pompage pour préparer une nouvelle solution de cristallisation en injectant du NaCl à une concentration inférieure à la précédente (0,75 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4). Injectez la nouvelle solution dans la chambre du réservoir(figure 11, étapes : 6,7) et répétez le flux de travail d’optimisation de la croissance de cristallisation tel que décrit à la section 2.3. Une population uniforme de cristaux plus gros sera générée. Les résultats présentés à la figure 11 ont été obtenus après quelques jours.

Representative Results

Dans les sections 2.3 et 2.4, trois exemples de croissance optimisée du cristal sont présentés, montrant l’utilisation de l’instrument et une conception expérimentale pour la culture de gros cristaux. Pour cette démonstration, nous avons utilisé le lysozyme comme protéine modèle, bien que des expériences de croissance cristalline aient été réalisées avec succès avec de nombreux autres systèmes protéiques utilisant cette méthode (voir ci-dessus). En utilisant et en maîtrisant le protocole présenté ici, on peut l’adapter à d’autres candidats protéinés. À la section 2.3, nous avons démontré que des stratégies de cristallisation rationnelles établies pouvaient être bénéfiques dans la croissance des cristaux avec des volumes de diffusion suffisants pour la cristallographie des protéines neutroniques. Ici, nous démontrons que les stratégies d’optimisation rationnelle proposées permettent également la génération d’une population uniforme de cristaux de toute taille spécifique nécessaire pour les approches de détermination de la structure en aval. Ces deux expériences sont conçues pour souligner l’importance des diagrammes de phase dans le contrôle de la nucléation et de la croissance des cristaux. Ici, le contrôle de la température et la composition chimique des solutions de cristallisation en combinaison avec la surveillance du processus de cristallisation en temps réel sont utilisés pour étudier le diagramme de phase qualitative. En utilisant cette méthode, la nucléation et la croissance des cristaux peuvent être rationnellement optimisées d’une manière réversible. L’utilisation d’une telle approche sérielle réduit également la quantité de protéines et le temps nécessaire pour contrôler la taille et la qualité des cristaux. Dans la méthode de dialyse, une solution protéique est séparée d’une solution de cristallisation par une membrane semi-perméable6 (figure 5). Cette membrane de dialyse permet aux petites molécules telles que les additifs, le tampon et les ions de passer à travers la membrane, mais pas les macromolécules telles queles protéines 6,20. Cette fonctionnalité permet de modifier la solution de cristallisation au cours de l’expérience6. L’échange de la solution peut se faire manuellement, par exemple en boutons de microdialyse, ou de manière automatisée à l’aide d’un instrument développé à cette fin, OptiCrys8. Dans la première série d’expériences, des boutons de microdialyse ont été utilisés pour la cristallisation du lysozyme blanc d’œuf de poulet. Les boutons de microdialyse ont été immergés dans des solutions de cristallisation avec différentes concentrations de sel. Dans cette simple expérience de grille de cristallisation, la seule variable est la concentration de précipités tandis que la température est maintenue constante (293 K). Comme le montre la figure 4,de légères variations de la concentration en sel induisent un changement dans la taille et le nombre de cristaux observés, ce qui permet d’étude du diagramme de phase de cristallisation. Dans la figure 4, panneau 1, la solution de cristallisation contient 0,7 M NaCl et un nombre limité de cristaux plus gros sont apparus dans les boutons. En augmentant la concentration de sel de 0,7 à 1,2 M, la sursaturation augmente et la solution dans la zone de nucléation s’éloigne de la zone métastable(figure 4,panneaux 1 à 6). En conséquence, le nombre de cristaux augmente et leur taille diminue. Dans la première expérience avec un instrument entièrement automatisé permettant la cristallisation de dialyse à température contrôlée, OptiCrys (Figure 9), l’expérience de croissance du cristal a été conçu pour générer une grande croissance cristalline. L’expérience a été lancée à une température initiale de 295 K avec une solution de cristallisation contenant 0,75 M NaCl et 0,1 M Na tampon d’acétate pH 4. Dans ces conditions expérimentales, la solution de cristallisation a atteint la zone de nucléation à proximité de la zone métastable du diagramme de phase (figure 9, flèche 1). En conséquence, seuls quelques noyaux ont été générés au cours de la première étape de l’expérience. Afin de faire pousser davantage certains cristaux (indiqués dans la figure 9),le flux de travail d’optimisation de la croissance cristalline a été orienté vers la zone métastable par une température variable dès que l’équilibre cristallin a été atteint. Chaque fois que l’équilibre entre le cristal et la solution a été atteint, la température a été abaissée, d’abord à 291 K, puis à 288 K et enfin à 275 K, pour maintenir la solution de cristallisation dans la zone métastable. Le résultat de cette expérience est un seul grand cristal adapté à la fois aux rayons X macromoléculaires et à la cristallographie neutronique. Pour la plupart des protéines, le diagramme de phase quantitative précis (ou tout simplement un diagramme qualitatif) n’a pas encore été obtenu en raison du manque de dispositifs expérimentaux capables de mesurer avec précision la concentration de protéines (ou tout simplement d’observer/détecter le processus de cristallisation en temps réel) lors des expériences de cristallisation18. Par conséquent, il n’est souvent pas possible de concevoir l’expérience de manière à ce que la cristallisation commence dans la zone optimale du diagramme de phase, à proximité de la zone métastable. Par conséquent, une étude d’optimisation de cristallisation doit avoir lieu avant que l’expérience consacrée à la croissance d’un cristal à grand volume ne soit entreprise. Dans cette étude, en utilisant des variations de température (à composition chimique constante) d’une part et des variations de composition chimique (à température constante) d’autre part, sont nécessaires pour identifier la zone métastable et pour délimité les conditions optimales pour commencer une grande expérience de croissance cristalline. À cette fin, deux autres expériences ont été présentées qui ont été conçues pour démontrer la réversibilité des expériences de cristallisation de dialyse à température contrôlée avec OptiCrys pour la nucléation, la croissance des cristaux, la dissolution et la re-croissance. Le flux de travail d’optimisation de la croissance cristalline a été contrôlé de sorte qu’une population uniforme de cristaux de lysozyme moins gros a été cultivée, en utilisant la variation de température ou la concentration de précipitation. Dans la deuxième expérience avec OptiCrys, la composition chimique de la solution de cristallisation a été maintenue constante tout au long de l’expérience (0,9 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4) à température variable. La température initiale a été fixée à 291 K. Les résultats de cette expérience sont résumés à la figure 10. En raison de la sursaturation élevée, un grand nombre de petits cristaux sont apparus dans la chambre de cristallisation(figure 10,panneaux 1 et 2). Conformément au concept de solubilité directe des protéines, en augmentant graduellement la température à 313 K, tous les cristaux ont été dissous(figure 10,panneaux 3, 4 et 5). Enfin, en abaissant la température à 295 K, la deuxième nucléation a été initiée à proximité de la zone métastable et a permis la formation contrôlée d’un nombre inférieur de noyaux. Une nouvelle croissance du cristal a entraîné la génération uniforme d’une population de cristaux plus gros(figure 10, panneau 7). Comme le montre la figure 11, la variation de la composition chimique de la solution de cristallisation, à une température constante de 291 K, peut également être utilisée pour obtenir une population uniforme de cristaux plus gros. Semblable à l’expérience précédente, la condition initiale était 0.9 M NaCl dans 0.1 M CH3COONa pH 4. La concentration de NaCl a ensuite été abaissée graduellement de 0,9 M à zéro pour dissoudre les cristaux(figure 11,panneaux 4 et 5). À ce stade, NaCl a été complètement remplacé par une solution tampon de 0,1 M CH3COONa pH 4. La réduction de la concentration de sel maintient la solution dans la zone sous-saturée du diagramme de phase, ce qui conduit à la dissolution des cristaux. Puis, une nouvelle solution de cristallisation avec une résistance ionique inférieure, à 0,75 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4, a été injectée dans la chambre du réservoir. À cette concentration précipitée, les premiers noyaux sont apparus(figure 11, panneau 6) après 90 minutes. Le nombre de cristaux générés était plus faible et les cristaux atteignait un volume plus important(figure 11,panneau 7) qu’auparavant. Figure 1 : Diagramme de phase schématique. Les trajectoires cinétiques pour trois techniques de cristallisation sont représentées dans un régime de salage. Chaque méthode atteint la nucléation et la cristallisation différemment, visualisées par une voie cinétique différente à travers le diagramme de phase pour atteindre la nucléation et les zones métastables. La courbe de solubilité sépare les régions de sous-saturation et de sursaturation. La sursaturation est divisée en trois zones : métastable, nucléation et précipitations. Dans la zone de nucléation, la nucléation spontanée se produit tandis que dans la zone métastable la croissance cristalline a lieu. Cette figure est adaptée de Junius et coll. 8 Veuillezcliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Représentation schématique du banc de cristallisation (OptiCrys). La source lumineuse LED est située au-dessus de la cellule d’écoulement de dialyse à température contrôlée. Un microscope inversé et l’appareil photo numérique sont affichés en haut à droite de l’image avec la flèche rouge. Le cercle rouge représente l’emplacement du tube refroidisseur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Diagramme schématique de phase de cristallisation des protéines bidimensionnelles en fonction de la température (A) et de la concentration des précipités (B). (A) Dans le cas d’une protéine à solubilité directe, la diminution de la température maintient la solution de cristallisation dans la zone métastable. La variation de température peut être répétée plusieurs fois pour contrôler le processus de croissance du cristal jusqu’à ce que les cristaux avec le volume désiré soient obtenus. (B) La modification de la concentration de la solution précipitante peut également être utilisée pour maintenir la solution de cristallisation dans la zone métastable pour la croissance des cristaux. Cette figure est adaptée de Junius et coll. 8 Veuillezcliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Cristaux de lysozyme obtenus à l’aide de la méthode de dialyse. Cette expérience a été réalisée à une température constante de 293 K dans 0,1 M de pH tampon d’acétate de sodium pH 4. L’augmentation de la concentration de NaCl de 0,7 M à 1,2 M augmente le taux de nucléation et entraîne un plus grand nombre de cristaux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Aperçu du processus de cristallisation des protéines par la méthode de dialyse. (A) En ajoutant la protéine à la chambre du bouton de dialyse, (B) une forme de dôme est créée sur le dessus de la chambre. (C) Un applicateur est utilisé pour transférer l’anneau O à la rainure du bouton de dialyse afin de fixer la membrane de dialyse en place. (D) Le bouton de dialyse est prêt pour l’immersion dans la solution du réservoir. (E) La solution de cristallisation traverse la membrane semi-perméable et les cristaux commencent à se former à l’intérieur de la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : Vue schématique de la configuration de dialyse fluide à température contrôlée. (A) L’échantillon de protéines est ajouté à la chambre de dialyse. (B) La membrane de dialyse est fixée sur la surchamber avec un anneau O à l’aide d’un applicateur. (C) La chambre de surchambre est tournée et fixée sur le dessus de la chambre de dialyse. Les flèches blanches indiquent où les vis sont placées sur la chambre à coucher. (D) La chambre du réservoir est tournée dans le sens des aiguilles d’une montre (E) et fixée au-dessus de la chambre à coucher. (F) La chambre du réservoir est recouverte d’un bouchon hermétique avec des connecteurs à un système de pompage et (G) la cellule d’écoulement est placée dans le support en laiton. Cette figure est adaptée de Junius et coll. 8 Veuillezcliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 7 : Préparation et injection de la solution de cristallisation dans le réservoir par le système fluidique (A). Les tubes contenant du sel et de l’eau sont reliés au contrôleur de pression/vide (B) et à la valve rotative (C). En utilisant la pression, le contrôleur de pression/vide crée un flux constant des liquides des tubes à la valve rotative. Chaque liquide passant par le débitmètre (D) et l’interrupteur est injecté dans le tube de mélange (F). Une fois que tous les liquides ont été ajoutés au tube de mélange, le commutateur par quelques modifications injecte la solution finale du tube de mélange dans le réservoir (G). Le liquide coule à travers le système dans la direction des flèches dans le diagramme marqué dans l’ordre ascendant (de 1 à 6). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 8 : Vue de maintenance du logiciel de supervision. Cette vue est utilisée pour contrôler différents paramètres tels que la température, la lumière, la solution de cristallisation et le zoom. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 9 : Diagramme de phase en fonction de la température (les images sélectionnées doivent être suivies dans l’ordre ascendant). Un seul gros cristal de lysozyme est obtenu en changeant systématiquement la température de 295 K à 275 K. À chaque étape, la croissance du cristal est arrêtée en atteignant la courbe de solubilité. Réduire la température en maintenant la solution dans la zone métastable redémarre la croissance du cristal. Les images ont différents niveaux de grossissement. Cette figure est adaptée de Junius et coll. 8,18 S’ilvous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 10 : Optimisation de la croissance des cristaux à composition chimique constante à l’aide du contrôle de la température (certaines images doivent être suivies dans l’ordre ascendant). Le démarrage du processus de nucléation dans la zone de nucléation à 291 K, loin de la zone métastable, entraîne la formation de nombreux cristaux. L’augmentation de la température à 313 K dissout ensuite les cristaux jusqu’à ce qu’aucun noyau visible ne soit vu dans la chambre de dialyse. Enfin, la baisse de la température à 295 K redémarre le processus de nucléation pour la deuxième fois conduisant à un nombre limité de cristaux plus gros. Cette figure est adaptée de Junius et coll. 8,18 S’ilvous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 11 : Optimisation de la croissance des cristaux à température constante à l’aide de variations de concentration de précipités (certaines images doivent être suivies dans l’ordre ascendant). La diminution de la concentration de précipitation de 0,9 M à 0 M dissout les cristaux obtenus lors du premier événement de nucléation. Le processus de cristallisation est redémarré par l’injection du même précipité mais à une résistance ionique inférieure, 0,75 M, ce qui conduit à la formation de quelques cristaux plus gros. Cette figure est adaptée de Junius et coll. 8,18 S’ilvous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Différentes variables physiques, chimiques et biologiques influencent la cristallisation des protéines en affectant la solubilité protéique21. Parmi ces variables, la température et la composition chimique de la solution de cristallisation sont utilisées ici en combinaison avec la technique de dialyse pour améliorer et cultiver de grands cristaux de haute qualité de biomacromolecules pour les études de diffraction neutronique. En utilisant la connaissance des diagrammes de phase, la cristallisation est rendue plus prévisible. Bien que le criblage des différentes conditions de cristallisation dans une approche sérielle soit également possible, l’objectif principal d’utiliser les approches rationnelles présentées est de séparer et de contrôler la cinétique de la nucléation et de la croissance cristallines.

Comme toutes les études de cristallisation, des échantillons de protéines pures et homogènes de haute qualité et des solutions de cristallisation sans poussière augmentent le taux de réussite de l’expérience. La filtration et la centrifugation des solutions sont des étapes essentielles dans les protocoles décrits. Connaître les propriétés physicochimiques des protéines étudiées telles que le poids moléculaire (pour choisir la membrane de dialyse appropriée), le point isoélectrique, et la solubilité protéique sont cruciales pour la conception d’une expérience optimale de croissance cristalline. En outre, il faut tenir compte de la stabilité des protéines à des températures différentes ou avec différents produits chimiques pour prévenir la perte d’échantillons et augmenter les chances de succès. Compte tenu de la plage de température d’OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), un large éventail de protéines peuvent être cristallisées à l’aide de celui-ci. Mais il convient de souligner que les protéines qui sont principalement thermo-stables, telles que les protéines provenant de sources thermophiles, bénéficieraient le plus dans les expériences de croissance des cristaux à grand volume contrôlées par la température offertes par cet instrument.

À l’aide d’une chambre de dialyse à faible volume (lors de l’utilisation des boutons OptiCrys) ou de microdialyse et du criblage de plusieurs températures et conditions de cristallisation (p. ex., grilles de concentration ou de pH précipités), il est possible d’obtenir des informations sur l’emplacement de la limite de la zone métastable (équilibre cinétique entre la nucléation et les zones métastables). Ceci est inestimable lors de la conception d’une expérience réussie de croissance du cristal en particulier pour les nouveaux candidats protéinés dans la cristallisation. Sans cette information, les expériences peuvent partir d’une zone du diagramme de phase avec une sursaturation élevée, trop loin de la limite de la zone métastable pour contrôler facilement la nucléation cristalline. Bien que la dissolution du précipité protéique puisse être tentée, par exemple en augmentant la température en cas de solubilité directe, pour les protéines dont la thermostabilité est réduite, le maintien de l’échantillon à haute température pendant une plus longue période peut rendre les précipitations protéiques irréversibles. Ainsi, la meilleure stratégie consiste à utiliser une condition initiale avec une sursaturation inférieure située près de la limite de la métastabilité, où la nucléation peut être contrôlée et les précipitations protéiques évitées. Dans cette lignée, le pré-dépistage de la cristallisation diminue les chances d’avoir un précipité protéique dans la chambre de dialyse et augmente le taux de réussite de l’expérience.

Après avoir conçu une expérience, la préparation de chambres de dialyse (OptiCrys) ou de boutons de microdialyse est une autre étape importante. La prévention de la formation de bulles d’air dans la chambre/bouton de dialyse augmente les chances de cristallisation réussie, surtout lorsque de petits volumes sont utilisés. La présence de bulles d’air dans la chambre de dialyse peut également modifier la cinétique du processus de cristallisation et réduire la reproductibilité de l’expérience (parce que la surface de contact protéine/solution a été modifiée). Non seulement la protéine, mais aussi la solution de cristallisation peut affecter le succès de l’expérience. L’utilisation de nouveaux tubes de 50 mL pour le système de pompage chaque fois que l’on veut commencer une nouvelle expérience et le lavage des tubes après chaque expérience diminue les risques de contamination et évite la création de cristaux de sel dans l’appareil.

L’utilisation de boutons de microdialyse est une alternative lorsque OptiCrys n’est pas disponible. Les stratégies d’optimisation de la cristallisation et de suivi de la croissance du cristal mentionnées ci-dessus doivent être menées manuellement. En règle générale, cela nécessite d’être en dehors d’un incubateur thermoréguléré, ce qui peut être problématique lorsque la régulation de la température est une étape critique dans la méthodologie décrite. Cela ne facilite pas la modification de la composition chimique des solutions de cristallisation, ni la surveillance de la croissance du cristal par imagerie, de sorte que le processus de croissance du cristal ne peut pas être contrôlé en temps réel.

La connaissance du diagramme de phase est à la base de l’utilisation du banc de cristallisation, OptiCrys, pour cultiver systématiquement de gros cristaux de haute qualité de manière automatisée. Le contrôle des paramètres physicochimiques tels que la température, la concentration des précipités et le pH pendant la cristallisation déplace l’équilibre protéine-solution dans une trajectoire cinétique bien définie à travers le diagramme de phase. Ceci est complété par l’utilisation d’une membrane de dialyse pour ajuster le transport de masse et créer un gradient contrôlé dans la chambre de cristallisation qui affecte la taille et la qualité des cristaux. Par conséquent, l’utilisation de données thermodynamiques et de trajectoires cinétiques est essentielle pour contrôler le processus de cristallisation afin de cultiver des cristaux de haute qualité. Grâce à OptiCrys, les diagrammes de phase systématiques dans un espace multidimensionnel peuvent être étudiés avec une approche sérielle en utilisant beaucoup moins de matériaux qu’auparavant. Pour démontrer cette méthodologie, nous fournissons ici une étude de cas avec une protéine modèle, le lysozyme blanc d’œuf de poulet. En utilisant et en maîtrisant le protocole présenté ici, on peut l’adapter à de vrais systèmesprotéiques 5,14,17,18.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS reconnaît le soutien du LABEX VALO GRAL dans le cadre du contrat 2015. NJ reconnaît le Programme international de recherche doctorale (Irtelis) du CEA pour la bourse de doctorat. Les auteurs reconnaissent le financement du Programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie numéro 722687. Les auteurs sont également reconnaissants au Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) et au Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) pour leurs conversations et leurs idées utiles. IBS reconnaît son intégration à l’Institut interdisciplinaire de recherche de Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator
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Crystal GrowthNeutron Macromolecular CrystallographyDialysis MethodTemperature-controlled Dialysis CrystallizationMicro Dialysis ButtonsLysozymeNucleationMetastable ZoneOptiCrysPhase DiagramProtein Crystallization

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Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova – Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).
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