Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Функция гемово-мозгового барьера
Гемово-мозговой барьер (BBB) образует границу, которая ограничивает движение веществ из крови в мозг. BBB состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга (BMECs), которые образуют монослой, выстилающий сосуды. БМЕК вместе со астроцитами, нейронами, перицитами, микроглией и внеклеточной матрицей образуют нервно-сосудистый блок. BMECs имеют жестко регулируемую параклеточную структуру, которая позволяет BBB поддерживать высокое транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), которое ограничивает пассивную диффузию и служит индикатором барьерной^{целостности 1,2}. BMECs также имеют белки, которые помогают с трансклеточного движения, такие как эндоцитоз, трансцитоз, и трансмиграции, а также экстравазии лейкоцитов во время иммунного^{ответа 3}. BMECs полагаться на приток и эффлюкс транспортеров для питания и удаления отходов, для того, чтобы поддерживать гомеостатический баланс в головном мозге³. Например, solute перевозчика семьи 2 члена 1 (SLC2A1) является приток транспортер отвечает за движение глюкозы через BBB⁴, в то время как efflux транспортеры, такие как ATP связывания кассеты субсемейный член B 1 (ABCB1) и ATP связывания кассеты субсемейный член C 1 (ABCC1) несут ответственность за возвращение субстратов обратно в кровоток^3,5,7. ABCB1 субстраты включают морфин, verapamil⁴, и антипсихотики, такие как оланзапин и^{рисперидон 8}, в то время как транспортер ABCC1 имеет различные субстраты, включая сульфатные конъюгаты, винкристин, и глюкуронид^{конъюгирует 4}.

Применение моделей BBB при психических расстройствах
BBB дисфункция была вовлечена в ряд неврологических и психических расстройств, в том числе шизофрении и биполярного^{расстройства 9,10}. В последнее время, iPSC полученных ex vivo клеточных моделей в настоящее время используются для допроса клеточных и молекулярных основ психических расстройств, но эти модели в настоящее время не принимают во внимание потенциальную роль, которую играет нейроваскулатура^11,12,13. Предполагается, что периферические воспалительные цитокины, циркулирующие в^крови,могут негативно повлиять на BBB^14,15,16,17,но есть также доказательства для параклеточных¹⁸,^19,20,21,22, трансцеллюлярные^{23,24,25,26,27,28,29},^и внеклеточной^{матрицы 20,29,30,31,32 аномалии} способствует дисфункции BBB. Нарушение BBB может привести к содержанию крови, поступающих в мозг паренхима и активации астроцитов и / или микроглии, чтобы освободить провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, инициировать^{воспалительные реакции 33,} которые могут иметь пагубные последствия^{для мозга 34}. BMECs являются основным компонентом BBB и изучения структуры и функции этих клеток может повысить понимание дисфункции BBB в неврологических и психических расстройств.

Альтернативные модели BMEC
До разработки эффективных протоколов для получения BMECs от iPSCs^1,6,35,36, исследователи использовали увековеченные BMECs³⁷ для изучения функции BBB. Тем не менее, многие из этих моделей не смогли достичь желаемого BBB фенотипов, такой физиологический диапазон значений TEER^38,39. Использование iPSCs имеет то преимущество, сохраняя генетический фон человека, из которого клетки получены. Ученые активно работают над созданием iPSC-производных ex vivo микросреду модели, которые резюмируют структуру и функцию человеческого мозга. Исследователи разработали методы для получения BMECs, которые структурно и физиологически похожи на BMECs найти in vivo. Методы получения очищенных популяций БМЕК, полученных из iPSC, требуют ряда различных шагов, при этом в последние несколько^{лет оптимизированы протоколы 1,6,35,36.} Как правило, БМЕК, полученные iPSC, культурированы в среде Essential 6 (E6) в течение 4 дней, а затем в течение 2 дней в эндотелиальной сыворотке человека свободной среды (hESFM) дополняется основным фактором роста фибробластов (bFGF), ретинойной кислоты (RA), и B27 дополнения. Клетки затем культури на коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) матрицы для получения 90% однородных BMECs¹.

Идентичность БМЕК подтверждается иммунофлуоресценцией, показывающей совместное выражение белков BMEC, включая тромбоцитно-эндотелиарную молекулу адгезии клеток-1 (PECAM1), SLC2A1, и жесткие белки соединения, такие как плотный белок соединения 1 (TJP1), occludin (OCLN) и claudin-5 (CLDN5)^6. Прорастание анализы были использованы для подтверждения ангиогенного потенциала IPSC полученных БМЕК. ⁶ Целостность BMECs BBB оценивается наличием физиологических значений IN vitro TEER (2000 х см^{2) 37}и^{измеримой} активностью для транспортеров эффлюкса, таких как ABCB1 и ABCC1^1,6,36. Недавние методологические достижения группы Lippmann привели к iPSC-производным протоколам BMEC с уменьшенной экспериментальной изменчивостью и повышенной воспроизводимостью¹. Однако неизвестно, могут ли они быть расширены и выйти за пределы субподготовной стадии. Наш измененный протокол направлен на решение этой проблемы путем прохода BMECs, полученных iPSC, за 8-й день и оценки того, могут ли они быть дополнительно расширены, чтобы сохранить свойства BBB после криоконсервации. Хотя никакие исследования не описали прохождение IPSC полученных BMECs, протокол существует для криоконсервации BMEC, который сохраняет физиологические свойства BBB после прохождения замораживания оттепели^{цикла 40}. Тем не менее, не известно, после криоконсервации BMECs могут быть провечены и сохранить свойства BBB.

BMECs, полученные из iPSCs с помощью протокола Lippmann были использованы для моделирования BBB нарушения неврологических расстройств, таких как болезнь Хантингтона⁷. Такие БМЕК, полученные iPSC, также использовались для исследования влияния бактериальной инфекции, такой как Neisseria meningitidis или Group B Streptococcus на нарушение гембо-CSF барьера и BBB соответственно^41,42. Кроме того, используя IPSC полученных BMECs от 22q удаления синдрома пациентов с шизофренией, исследователи наблюдали увеличение межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1), основные молекулы адгезии в BMECs, которые помогают с набором и экстравазии^{лейкоцитов в мозг 43}. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют полезность IPSC полученных БМЕК для изучения BBB нарушения в сложных нейропсихиатрических расстройств.