Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Fonction barrière céphalo-cérébrale
La barrière céphalo-encéphalique (BBB) forme une limite qui limite le mouvement des substances du sang vers le cerveau. Le BBB est composé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs) qui forment un monocouche tapissant la vascularisation. Les BMEC, ainsi que les astrocytes, les neurones, les péricytes, les microglies et la matrice extracellulaire, forment l’unité neurovasculaire. Les BMEC ont une structure paracellulaire étroitement régulée qui permet au BBB de maintenir une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER), ce qui limite la diffusion passive et sert d’indicateur de^{l’intégrité de la barrière 1,2}. Les BMEC ont également des protéines qui aident au mouvement transcellulaire tel que l’endocytose, la transcytose, et la transmigration, aussi bien que l’extravasation des leucocytes pendant une réponse immunisée^3. Les BMEC comptent sur l’afflux et les transporteurs d’efflux pour nourrir et enlever les déchets, afin de maintenir un équilibre homéostatique dans le^{cerveau 3}. Par exemple, solute transporteur famille 2 membre 1 (SLC2A1) est un transporteur d’afflux responsable du mouvement du glucose à travers le BBB⁴, tandis que les transporteurs efflux tels que la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 (ABCB1) et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 (ABCC1) sont responsables du retour des substrats dans le flux^{sanguin 3,5,6,7}. Les substrats ABCB1 comprennent la morphine, le verapamil⁴et les antipsychotiques tels que l’olanzapine et la rispéridone^8,tandis que le transporteur ABCC1 a une variété de substrats, y compris les conjugués de sulfate, la vincristine et les conjugués au glucuronide⁴.

Application de modèles BBB dans les troubles psychiatriques
Le dysfonctionnement de BBB a été impliqué dans un certain nombre de désordres neurologiques et psychiatriques, y compris la schizophrénie et le désordre^{bipolaire 9,10.} Récemment, des modèles cellulaires ex vivo dérivés de l’iPSC sont utilisés pour interroger les fondements cellulaires et moléculaires des troubles psychiatriques, mais ces modèles ne prennent actuellement pas en compte le rôle potentiel joué par la neurovasculature^11,12,13. On émet l’hypothèse que les cytokines inflammatoires périphériques circulant dans le sang peuvent avoir un impact négatif sur le BBB^14,15,16,17, mais il ya aussi des preuves pour paracellulaire^{18,19,20,21,22}, transcellulaire^{23,24,25,26,27,28,29},^et la matrice extracellulaire^{20,29,30,31,32} anomalies contribuant au dysfonctionnement BBB. La perturbation du BBB peut avoir comme conséquence le contenu du sang entrant dans le parenchyme de cerveau et activant des astrocytes et/ou des microglies pour libérer des cytokines proinflammatory, qui à leur tour initient une réponse^{inflammatoire 33 qui} peut avoir des effets préjudiciables sur^{le cerveau 34.} Les BMEC sont la composante principale du BBB et l’examen de la structure et de la fonction de ces cellules peut améliorer la compréhension du dysfonctionnement de BBB dans les désordres neurologiques et psychiatriques.

Modèles alternatifs BMEC
Avant l’élaboration de protocoles efficaces pour l’exploitation des BMECs à partir d’iPSC^1,6,35,36, les chercheurs avaient utilisé des BMECs^{immortalisés 37} pour étudier la fonction BBB. Cependant, beaucoup de ces modèles n’ont pas atteint les phénotypes souhaitables de BBB, une telle gamme physiologique des valeurs de TEER^38,39. L’utilisation d’iPSCs a l’avantage de conserver le contexte génétique de l’individu à partir duquel les cellules sont dérivées. Les scientifiques travaillent activement à l’établissement de modèles de microenvironnement ex vivo dérivés de l’iPSC qui récapitulent la structure et la fonction du cerveau humain. Les chercheurs ont mis au point des méthodes pour obtenir des BMEC qui sont structurellement et physiologiquement similaires aux BMECs trouvés in vivo. Les méthodes d’obtention de populations purifiées de BMEC dérivés de l’iPSC nécessitent un certain nombre d’étapes différentes avec des protocoles optimisés au cours des^{dernières années 1,6,35,36}. Généralement, les BMECs iPSC-dérivés sont cultivés dans le milieu essentiel 6 (E6) pendant 4 jours, suivis de 2 jours dans le milieu sans sérum endothélial humain (hESFM) complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF), l’acide rétinoïque (RA), et le supplément de B27. Les cellules sont ensuite cultivés sur une matrice de collagène IV (COL4) et de fibronectine (FN) pour obtenir >90% homogène BMECs¹.

L’identité des BMEC est confirmée par immunofluorescence montrant la co-expression des protéines BMEC, y compris la molécule d’adhérence des cellules plaquettaire-endothéliales-1 (PECAM1), SLC2A1, et les protéines de jonction serrées telles que la protéine de jonction serrée 1 (TJP1), l’occludine (OCLN) et la claudin-5 (CLDN5)⁶. Des analyses de germination ont été employées pour confirmer le potentiel angiogenic des BMECs iPSC-dérivés. ⁶ L’intégrité BBB des BMEC est évaluée par la présence de valeurs physiologiques in vitro TEER (~2000Ω x cm²)³⁷ et d’activité mesurable pour les transporteurs d’efflux tels que ABCB1 et ABCC1^1,6,36. Les progrès méthodologiques récents du groupe Lippmann ont conduit à des protocoles BMEC dérivés de l’iPSC avec une variabilité expérimentale réduite et une reproductibilité^{accrue 1}. Cependant, on ne sait pas s’ils peuvent être étendus et transmis au-delà de l’étape de la sous-culture. Notre protocole modifié vise à résoudre ce problème en réussissant les BMEC dérivés de l’iPSC au-delà du jour 8 et en évaluant s’ils peuvent être encore élargis pour conserver les propriétés BBB après cryopréservation. Bien qu’aucune étude n’ait décrit le passage des BMECs iPSC-dérivés, un protocole existe pour la cryopréservation de BMEC qui retient des propriétés physiologiques de BBB après avoir subi un cycle de gel-dégel^40. Cependant, il n’est pas connu après la cryopréservation BMECs peuvent être adoptés et conserver les propriétés BBB.

Les BMECs dérivés d’iPSCs utilisant le protocole Lippmann ont été utilisés pour modéliser la perturbation bbb dans les troubles neurologiques tels que la maladie de Huntington⁷. Ces BMECs iPSC-dérivés ont également été utilisés pour étudier les effets de l’infection bactérienne telle que Neisseria meningitidis ou Streptococcus de groupe B sur la perturbation de la barrière de sang-CSF et BBB^{respectivement 41,42.} En outre, utilisant des BMECs iPSC-dérivés des patients de syndrome de suppression de 22q présentant la schizophrénie, les chercheurs ont observé une augmentation de molécule d’adhérence intercellulaire-1 (ICAM-1), une molécule importante d’adhérence dans les BMECs qui aident au recrutement et à l’extravasation des leucocytes dans le^{cerveau 43.} Prises ensemble, ces études démontrent l’utilité des BMECs iPSC-dérivés pour étudier la perturbation de BBB dans les désordres neuropsychiatriques complexes.