Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Blut-Hirn-Barriere-Funktion
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine Grenze, die die Bewegung von Substanzen aus dem Blut zum Gehirn einschränkt. Die BBB besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) des Gehirns, die eine Monoschicht bilden, die die Vaskulatur auskundaufzen. BMECs bilden zusammen mit Astrozyten, Neuronen, Pericyten, Mikroglia und extrazellulärer Matrix die neurovaskuläre Einheit. BMECs haben eine streng regulierte parazelluläre Struktur, die es dem BBB ermöglicht, einen hohen transendotheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) aufrechtzuerhalten, der die passive Diffusion begrenzt und als Indikator für die Barriereintegrität^1,2dient. BMECs haben auch Proteine, die bei der transzellulären Bewegung wie Endozytose, Transzytose und Transmigration sowie Extravasation von Leukozyten während einer Immunantwort unterstützen³. BMECs sind auf Zustrom- und Efflux-Transporter für die Ernährung und Entfernung von Abfallprodukten angewiesen, um ein heimelatisativer Gleichgewicht im Gehirn zu halten³. So ist beispielsweise die Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1) ein Zustromtransporter, der für die Bewegung von Glukose über die BBB⁴verantwortlich ist, während Efflux-Transporter wie die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B Member 1 (ABCB1) und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C Member 1 (ABCC1) für die Rückführung von Substraten in den Blutkreislauf verantwortlich sind^3,5,6,7. ABCB1-Substrate sind Morphin, Verapamil⁴und Antipsychotika wie Olanzapin und Risperidon⁸, während der ABCC1-Transporter eine Vielzahl von Substraten hat, einschließlich Sulfatkonjugate, Vincrinin und Glucuronid-Konjugate⁴.

Anwendung von BBB-Modellen bei psychiatrischen Störungen
BBB Dysfunktion wurde in eine Reihe von neurologischen und psychiatrischen Störungen verwickelt, einschließlich Schizophrenie und bipolare Störung^9,10. Kürzlich werden iPSC-abgeleitete ex vivo-Zellmodelle verwendet, um die zellulären und molekularen Grundlagen psychiatrischer Störungen zu hinterfragt, aber diese Modelle berücksichtigen derzeit nicht die potenzielle Rolle, die die Neurovaskulatur^11,12,13spielt. Es wird vermutet, dass periphere entzündliche Zytokine, die im Blut zirkulieren, die BBB^14,15,16,17, aber es gibt auch Beweise für parazelluläre^18,19,20,2^1,22, transzellulär^{23,24,25,26,27,28,29und} extrazelluläre Matrix^{20,29,30,31,32} Anomalien, die zur BBB Dysfunktion beitragen. Eine Störung des BBB kann dazu führen, dass der Inhalt des Blutes in das Blut parenchyma eintritt und aktivierte Astrozyten und/oder Mikroglia, um proinflammatorische Zytokine freizusetzen, die wiederum eine Entzündungsreaktion^{initiieren 33,} die schädliche Auswirkungen auf das Gehirn haben kann³⁴. BMECs sind die primäre Komponente der BBB und die Untersuchung der Struktur und Funktion dieser Zellen kann das Verständnis der BBB Dysfunktion bei neurologischen und psychiatrischen Störungen verbessern.

Alternative BMEC-Modelle
Vor der Entwicklung effizienter Protokolle zur Ableitung von BMECs aus iPSCs^1,6,35,36hatten Forscher verewigte BMECs³⁷ eingesetzt, um die BBB-Funktion zu untersuchen. Viele dieser Modelle erreichten jedoch keine wünschenswerten BBB-Phänotypen, wie einen physiologischen Bereich von TEER-Werten^38,39. Die Verwendung von iPSCs hat den Vorteil, dass der genetische Hintergrund des Individuums, aus dem die Zellen abgeleitet sind, erhalten bleibt. Wissenschaftler arbeiten aktiv an der Entwicklung von iPSC-abgeleiteten ex-vivo-Mikroumweltmodellen, die die Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns rekapitulieren. Die Forscher haben Methoden entwickelt, um BMECs abzuleiten, die strukturell und physiologisch ähnlich wie BMECs sind,die in vivo gefunden werden. Methoden zur Gewinnung gereinigter Populationen von iPSC-abgeleiteten BMECs erfordern eine Reihe verschiedener Schritte, wobei Protokolle in den letzten Jahren optimiert wurden^1,6,35,36. Im Allgemeinen werden iPSC-abgeleitete BMECs in Essential 6 (E6) Medium für 4 Tage kultiviert, gefolgt von 2 Tagen in humanen endothelialen Serum-freien Medium (hESFM) ergänzt mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor (bFGF), Retinsäure (RA), und B27 Ergänzung. Die Zellen werden dann auf einer Kollagen-IV-Matrix (COL4) und Fibronectin (FN) kultiviert, um >90% homogene BMECs¹zu erhalten.

Die Identität von BMECs wird durch Immunfluoreszenz bestätigt, die die Koexpression von BMEC-Proteinen einschließlich Thrombozyten-Endothel-Zelladhäsionsmolekül-1 (PECAM1), SLC2A1 und engen Knotenproteinen wie engem Knotenprotein 1 (TJP1), Occludin (OCLN) und Claudin-5 (CLDN5)⁶zeigt. Sprouting-Assays wurden verwendet, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu bestätigen. ⁶ Die BBB-Integrität von BMECs wird durch das Vorhandensein physiologischer in vitro TEER-Werte (2000 x cm²)³⁷ und messbare Aktivität für Efflux-Transporter wie ABCB1 und ABCC1^1,6,36. Jüngste methodische Fortschritte der Lippmann-Gruppe haben zu iPSC-abgeleiteten BMEC-Protokollen mit reduzierter experimenteller Variabilität und verbesserter Reproduzierbarkeit¹geführt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sie über die Unterkultivierungsstufe hinaus erweitert und durchdrungen werden können. Unser modifiziertes Protokoll zielt darauf ab, dieses Problem zu lösen, indem iPSC-abgeleitete BMECs über Tag 8 hinaus übergeben und bewertet werden, ob sie weiter ausgebaut werden können, um BBB-Eigenschaften nach der Kryokonservierung beizubehalten. Obwohl keine Studien die Passage von iPSC-abgeleiteten BMECs beschrieben haben, existiert ein Protokoll für die BMEC-Kryokonservierung, das physiologische BBB-Eigenschaften behält, nachdem sie einen Frost-Tau-Zyklus⁴⁰durchlaufen haben. Es ist jedoch nicht bekannt, dass BMECs nach der Kryokonservierung durchundlassen und BBB-Eigenschaften behalten können.

BMECs, die von iPSCs mit dem Lippmann-Protokoll abgeleitet wurden, wurden verwendet, um BBB-Störungen bei neurologischen Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit zu modellieren⁷. Solche iPSC-abgeleiteten BMECs wurden auch verwendet, um die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen wie Neisseria meningitidis oder Gruppe B Streptococcus auf Störung der Blut-CSF-Barriere und BBB bzw.^41,42zu untersuchen. Auch mit iPSC-abgeleiteten BMECs von 22q-Deletion-Syndrom-Patienten mit Schizophrenie, Forscher beobachteten eine Zunahme der interzellulären AdhäsionMolekül-1 (ICAM-1), ein wichtiges Adhäsionsmolekül in BMECs, die bei der Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten in das Gehirn⁴³helfen. Zusammengenommen zeigen diese Studien den Nutzen von iPSC-abgeleiteten BMECs für die Untersuchung von BBB-Störungen bei komplexen neuropsychiatrischen Störungen.