Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Bloed-hersenbarrièrefunctie
De bloed-hersenbarrière (BBB) vormt een grens die de beweging van stoffen van het bloed naar de hersenen beperkt. De BBB bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (BMECs) die een monolaag vormen langs de vasculatuur. BMECs vormen samen met astrocyten, neuronen, pericyten, microglia en extracellulaire matrix de neurovasculaire eenheid. BMECs hebben een strak gereguleerde paracellulaire structuur die de BBB in staat stelt een hoge trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) te handhaven, die passieve diffusie beperkt en dient als indicator voor barrière-integriteit^1,2. BMECs hebben ook eiwitten die helpen bij transcellulaire beweging zoals endocytose, transcytose en transmigratie, evenals extravasatie van leukocyten tijdens een immuunrespons³. BMECs vertrouwen op influx en efflux transporters voor voeding en verwijdering van afvalproducten, om een homeostatische balans in de hersenen te behouden³. Solute Carrier Family 2 member 1 (SLC2A1) is bijvoorbeeld een influx transporter die verantwoordelijk is voor de beweging van glucose over de BBB⁴, terwijl efflux transporters zoals de ATP binding cassette subfamilie B lid 1 (ABCB1) en de ATP binding cassette subfamilie C lid 1 (ABCC1) verantwoordelijk zijn voor het terugbrengen van substraten terug in de bloedstroom^3,5,6,7. ABCB1-substraten omvatten morfine, verapamil⁴en antipsychotica zoals olanzapine en risperidon⁸, terwijl de ABCC1-transporteur een verscheidenheid aan substraten heeft, waaronder sulfaatconjugaten, vincristine en glucuronideconjugaten⁴.

Toepassing van BBB-modellen bij psychiatrische stoornissen
BBB-disfunctie is betrokken bij een aantal neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder schizofrenie en bipolaire^{stoornis 9,10}. Onlangs werden van iPSC afgeleide ex vivo cellulaire modellen gebruikt om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van psychiatrische stoornissen te ondervragen, maar deze modellen houden momenteel geen rekening met de potentiële rol van de neurovasculatuur^11,12,13. Er wordt aangenomen dat perifere inflammatoire cytokinen die in het bloed circuleren een negatieve invloed kunnen hebben op de BBB^14,15,16,17, maar er is ook bewijs voor paracellulaire^{18,19,20,21,22}, transcellulaire^{23,24,25,26,27,28,29,} en extracellulaire matrix^{20,29,30,31,32 afwijkingen} die bijdragen aan BBB-disfunctie. Verstoring van de BBB kan ertoe leiden dat de inhoud van het bloed het hersenparenchym binnendringt en astrocyten en/of microglia activeert om pro-inflammatoire cytokinen vrij te geven, die op hun beurt een ontstekingsreactie^{initiëren 33} die schadelijke effecten op de hersenen kan hebben³⁴. BMECs zijn de primaire component van de BBB en het onderzoeken van de structuur en functie van deze cellen kan het begrip van BBB-disfunctie bij neurologische en psychiatrische stoornissen verbeteren.

Alternatieve BMEC-modellen
Voorafgaand aan de ontwikkeling van efficiënte protocollen voor het afleiden van BMECs uit iPSC’s^1,6,35,36,hadden onderzoekers vereeuwigde BMECs³⁷ gebruikt om de BBB-functie te bestuderen. Veel van deze modellen slaagden er echter niet in om wenselijke BBB-fenotypen te bereiken, zo’n fysiologisch bereik van TEER-waarden^38,39. Het gebruik van iPSC’s heeft het voordeel dat de genetische achtergrond van het individu waaruit de cellen zijn afgeleid, behouden blijft. Wetenschappers werken actief aan het opzetten van iPSC-afgeleide ex vivo micromilieumodellen die de structuur en functie van het menselijk brein samenvatten. Onderzoekers hebben methoden ontwikkeld om BMECs af te leiden die structureel en fysiologisch vergelijkbaar zijn met BMECs gevonden in vivo. Methoden voor het verkrijgen van gezuiverde populaties van iPSC-afgeleide BMECs vereisen een aantal verschillende stappen waarbij protocollen in de afgelopen jaren zijn geoptimaliseerd^1,6,35,36. Over het algemeen worden iPSC-afgeleide BMECs gedurende 4 dagen gekweekt in Essential 6 (E6) medium, gevolgd door 2 dagen in humaan endotheel serumvrij medium (hESFM) aangevuld met basis fibroblast groeifactor (bFGF), retinoïnezuur (RA) en B27 supplement. De cellen worden vervolgens gekweekt op een collageen IV (COL4) en fibronectine (FN) matrix om >90% homogene BMECs te verkrijgen¹.

De identiteit van BMECs wordt bevestigd door immunofluorescentie die de co-expressie van BMEC-eiwitten laat zien, waaronder bloedplaatjes-endotheelcelhechtingsmolecuul-1 (PECAM1), SLC2A1 en strakke verbindingseiwitten zoals tight junction protein 1 (TJP1), occludin (OCLN) en claudin-5 (CLDN5)⁶. Kiemtests zijn gebruikt om het angiogene potentieel van van iPSC afgeleide BMECs te bevestigen. ⁶ De BBB-integriteit van BMECs wordt beoordeeld door de aanwezigheid van fysiologische in vitro TEER-waarden (~2000Ω x cm²)³⁷ en meetbare activiteit voor effluxtransporters zoals ABCB1 en ABCC1^1,6,36. Recente methodologische vooruitgang van de Lippmann-groep heeft geleid tot iPSC-afgeleide BMEC-protocollen met verminderde experimentele variabiliteit en verbeterde reproduceerbaarheid¹. Het is echter niet bekend of ze kunnen worden uitgebreid en voorbij het sub-culturing stadium kunnen worden doorgetrokken. Ons gewijzigde protocol is bedoeld om dit probleem aan te pakken door iPSC-afgeleide BMECs na dag 8 door te geven en te beoordelen of ze verder kunnen worden uitgebreid om BBB-eigenschappen te behouden na cryopreservatie. Hoewel er geen studies zijn beschreven over het passeren van iPSC-afgeleide BMECs, bestaat er een protocol voor BMEC cryopreservatie dat fysiologische BBB-eigenschappen behoudt na het ondergaan van een vriesdooicyclus⁴⁰. Het is echter niet bekend dat BMECs na cryopreservatie kunnen worden doorgegang en BBB-eigenschappen behouden.

BMECs afgeleid van iPSC’s die het Lippmann-protocol gebruiken, zijn gebruikt om BBB-verstoring bij neurologische aandoeningen zoals de Ziekte van Huntington^{te modelleren 7}. Dergelijke van iPSC afgeleide BMECs zijn ook gebruikt om de effecten van bacteriële infectie zoals Neisseria meningitidis of Groep B Streptococcus op verstoring van de bloed-CSF-barrière en BBB respectievelijk^41,42te onderzoeken . Ook, met behulp van iPSC-afgeleide BMECs van 22q deletiesyndroom patiënten met schizofrenie, onderzoekers waargenomen een toename van intercellulaire adhesie molecuul-1 (ICAM-1), een belangrijke adhesie molecuul in BMECs die helpen bij de werving en extravasatie van leukocyten in de hersenen⁴³. Samen tonen deze studies het nut aan van iPSC-afgeleide BMECs voor het bestuderen van BBB-verstoring bij complexe neuropsychiatrische aandoeningen.