Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Função de barreira hemencefálica
A barreira hemencefálica (BBB) forma um limite que limita o movimento de substâncias do sangue para o cérebro. O BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) que formam uma monocamada que reveste a vasculatura. BMECs, juntamente com astrócitos, neurônios, periciosos, microglia e matriz extracelular, formam a unidade neurovascular. Os BMECs possuem uma estrutura paracelular bem regulada que permite ao BBB manter alta resistência elétrica trans-endotelial (TEER), que limita a difusão passiva e serve como indicador de integridade da barreira^1,2. Os BMECs também possuem proteínas que auxiliam no movimento transcelular, como endocitose, transcitose e transmigração, bem como extravasação de leucócitos durante uma resposta imune³. Os BMECs contam com transportes de influxo e efflux para nutrição e remoção de resíduos, a fim de manter um equilíbrio homeostático no cérebro³. Por exemplo, a família transportadora solute 2 membro 1 (SLC2A1) é um transportador de fluxo responsável pelo movimento de glicose através do BBB⁴, enquanto transportadores efflux como o subfamília de de ligação ATP membro B (ABCB1) e o membro C da fita c de ligação ATP 1 (ABCC1) são responsáveis por devolver substratos de volta à corrente sanguínea^3,5,6,7. Os substratos ABCB1 incluem morfina, verapamil⁴e antipsicóticos como olanzapina e risperidona^8,enquanto o transportador ABCC1 possui uma variedade de substratos, incluindo conjugados de sulfato, vincristina e conjugados de glucuronídeos⁴.

Aplicação de Modelos BBB em Transtornos Psiquiátricos
A disfunção bbb tem sido implicada em uma série de transtornos neurológicos e psiquiátricos, incluindo esquizofrenia e transtorno bipolar^9,10. Recentemente, modelos celulares ex vivo derivados do iPSC estão sendo utilizados para interrogar os fundamentos celulares e moleculares de transtornos psiquiátricos, mas esses modelos atualmente não levam em conta o potencial papel desempenhado pela neurovasculatura^11,12,13. É hipótese que citocinas inflamatórias periféricas que circulam no sangue podem impactar negativamente o BBB^14,15,16,17, mas também há evidências de paracelular^18,19,20,21^,122, transcelular^{23,24,25,26,27,28,29,} e matriz extracelular^{20,29,30,31,32} anormalidades contribuindo para a disfunção BBB. A interrupção do BBB pode resultar no conteúdo do sangue entrando no parenchyma cerebral e ativando astrócitos e/ou microglia para liberar citocinas proinflamatórias, que por sua vez iniciam uma resposta inflamatória³³ que pode ter efeitos prejudiciais no cérebro³⁴. Os BMECs são o componente primário do BBB e examinar a estrutura e a função dessas células pode melhorar a compreensão da disfunção BBB em transtornos neurológicos e psiquiátricos.

Modelos alternativos de BMEC
Antes do desenvolvimento de protocolos eficientes para o eduque de BMECs dos iPSCs^1,6,35,36, os pesquisadores haviam empregado BMECs^{imortalizados 37} para estudar a função BBB. No entanto, muitos desses modelos não conseguiram alcançar fenótipos BBB desejáveis, uma gama fisiológica de valores TEER^38,39. Utilizar iPSCs tem a vantagem de manter o fundo genético do indivíduo do qual as células são derivadas. Os cientistas estão trabalhando ativamente no estabelecimento de modelos de microambiente ex vivo derivados do iPSC que recapitulem a estrutura e a função do cérebro humano. Pesquisadores desenvolveram métodos para derivar BMECs que são estruturalmente e fisiologicamente semelhantes aos BMECs encontrados in vivo. Os métodos para a obtenção de populações purificadas de BMECs derivados do iPSC exigem uma série de etapas diferentes, com protocolos sendo otimizados nos últimos anos^1,6,35,36. Geralmente, os BMECs derivados do iPSC são cultivados em meio Essential 6 (E6) por 4 dias, seguidos por 2 dias em meio endotelial-livre de soro humano (hESFM) complementados com fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF), ácido retinóico (RA) e suplemento B27. As células são então cultivadas em uma matriz de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) para obter >90% BMECs homogêneos¹.

A identidade dos BMECs são confirmadas pela imunofluorescência que mostra a co-expressão de proteínas BMEC, incluindo molécula de adesão celular plaquetária-endotelial-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteínas de junção apertadas como proteína de junção apertada 1 (TJP1), occludina (OCLN) e claudin-5 (CLDN5)⁶. Ensaios de broto têm sido usados para confirmar o potencial angiogênico de BMECs derivados do iPSC. ⁶ A integridade BBB dos BMECs é avaliada pela presença de valores fisiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm²)³⁷ e atividade mensurável para transportadores de efflux como ABCB1 e ABCC1^1,6,36. Os recentes avanços metodológicos do grupo Lippmann levaram a protocolos BMEC derivados do IPSC com variabilidade experimental reduzida e reprodutibilidade aprimorada¹. No entanto, não se sabe se eles podem ser expandidos e passagens para além do estágio de subcultura. Nosso protocolo modificado visa resolver esse problema, aprovando BMECs derivados do iPSC para além do dia 8 e avaliando se eles podem ser expandidos para reter propriedades BBB após a criopreservação. Embora nenhum estudo tenha descrito a passagem de BMECs derivados do iPSC, existe um protocolo para a criopreservação BMEC que retém propriedades fisiológicas do BBB após passar por um ciclo de congelamento⁴⁰. No entanto, não se sabe se BMECs pós-criopreservação podem ser passagens e reter propriedades BBB.

BMECs derivados de iPSCs usando o protocolo Lippmann têm sido utilizados para modelar a interrupção do BBB em distúrbios neurológicos como a doença de Huntington⁷. Esses BMECs derivados do iPSC também têm sido usados para investigar os efeitos da infecção bacteriana, como neisseria meningitidis ou Estreptococos do Grupo B na interrupção da barreira hemo-CSF e^{BBB, respectivamente 41,42}. Além disso, usando BMECs derivados do iPSC de pacientes com síndrome de exclusão de 22q com esquizofrenia, os pesquisadores observaram um aumento na molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma molécula de adesão importante em BMECs que auxiliam no recrutamento e extravasação de leucócitos no cérebro⁴³. Juntos, esses estudos demonstram a utilidade dos BMECs derivados do iPSC para estudar a interrupção do BBB em distúrbios neuropsiquiátricos complexos.