Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Funzione barriera ematico-encefalica
La barriera eto-encefalica (BBB) forma un confine che limita il movimento delle sostanze dal sangue al cervello. La BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) che formano un monostrato che rivestono la vascolarizzazione. I BMEC, insieme ad astrociti, neuroni, periciti, microglia e matrice extracellulare, formano l’unità neurovascolare. I BMEC hanno una struttura paracellulare strettamente regolata che consente alla BBB di mantenere un’elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER), che limita la diffusione passiva e funge da indicatore di integrità^{della barriera 1,2}. I BMEC hanno anche proteine che aiutano con il movimento transcellulare come l’endocitosi, la tracitosi e la trasmigrazione, così come l’estravasazione dei leucociti durante una risposta immunitaria³. I BMEC si affidano ai trasportatori di afflussi ed efflux per il nutrimento e la rimozione dei prodotti di scarto, al fine di mantenere un equilibrio omeostatico nel^{cervello 3}. Ad esempio, solute carrier family 2 membro 1 (SLC2A1) è un trasportatore di afflusso responsabile del movimento del glucosio attraverso il BBB 4 ,^mentrei trasportatori efflux come la sottofamiglia di cassette binding ATP B membro 1 (ABCB1) e la sottofamiglia di cassette binding ATP membro C 1 (ABCC1) sono responsabili della restituzione dei substrati nel flusso^{sanguigno 3,5,6,7}. I substrati ABCB1 includono morfina, verapamil⁴e antipsicotici come olanzapina e risperidone⁸, mentre il trasportatore ABCC1 ha una varietà di substrati tra cui coniugati solfati, vincristina e coniugati^{glucuronide 4}.

Applicazione di modelli BBB nei disturbi psichiatrici
La disfunzione della BBB è stata implicata in una serie di disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui schizofrenia e disturbo^{bipolare 9,10}. Recentemente, i modelli cellulari ex vivo derivati da iPSC vengono utilizzati per interrogare le basi cellulari e molecolari dei disturbi psichiatrici, ma questi modelli attualmente non tengono conto del ruolo potenziale svolto dalla neurovascolarizzazione^11,12,13. Si ipotizza che le citochine infiammatorie periferiche che circolano nel sangue possano avere un impatto negativo sulla BBB^14,15,16,17, ma ci sono anche prove di^{paracellulare 18,19,20,21, 122}, matrice transcellulare^{23,24,25,26,27,28,29e} matrice extracellulare^{20,29,30,31,32} anomalie che contribuiscono alla disfunzione BBB. L’interruzione della BBB può comportare l’ingresso del contenuto di sangue nel parenchima cerebrale e l’attivazione di astrociti e / o microglia per rilasciare citochine proinfiammatorie, che a loro volta avviano una^{risposta infiammatoria 33} che può avere effetti dannosi sul^{cervello 34}. I BMEC sono la componente primaria della BBB e l’esame della struttura e della funzione di queste cellule può migliorare la comprensione della disfunzione BBB nei disturbi neurologici e psichiatrici.

Modelli BMEC alternativi
Prima dello sviluppo di protocolli efficienti per la derivazione di BMEC da iPSC^1,6,35,36, i ricercatori avevano utilizzato BMEC^{immortalati 37} per studiare la funzione BBB. Tuttavia, molti di questi modelli non sono riusciti a raggiungere i fenotipi BBB desiderabili, un tale intervallo fisiologico di valori TEER^38,39. L’utilizzo degli iPSC ha il vantaggio di mantenere il background genetico dell’individuo da cui derivano le cellule. Gli scienziati stanno lavorando attivamente alla definizione di modelli di microambiente ex vivo derivati da iPSC che ricapitolano la struttura e la funzione del cervello umano. I ricercatori hanno sviluppato metodi per ricavare BMEC strutturalmente e fisiologicamente simili ai BMEC trovati in vivo. I metodi per ottenere popolazioni purificate di BMEC derivati da iPSC richiedono una serie di passaggi diversi con protocolli ottimizzati negli ultimi^{anni 1,6,35,36}. Generalmente, i BMEC derivati da iPSC sono coltivati in mezzo Essential 6 (E6) per 4 giorni, seguiti da 2 giorni nel mezzo umano endoteliale senza siero (hESFM) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), acido retinoico (RA) e integratore B27. Le cellule vengono quindi coltivate su una matrice di collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) per ottenere >90% BMEC omogenei¹.

L’identità dei BMEC è confermata dall’immunofluorescenza che mostra la coesimozione di proteine BMEC tra cui molecola di adesione delle cellule piastrine-endoteliali-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteine di giunzione stretta come la proteina di giunzione stretta 1 (TJP1), l’occludina (OCLN) e la claudina-5 (CLDN5)⁶. I test di germinazione sono stati utilizzati per confermare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC. ⁶ L’integrità BBB dei BMEC è valutata dalla presenza di valori teer fisiologici in vitro (~2000Ω x cm²)³⁷ e attività misurabile per trasportatori di efflux come ABCB1 e ABCC1^1,6,36. I recenti progressi metodologici del gruppo Lippmann hanno portato a protocolli BMEC derivati da iPSC con ridotta variabilità sperimentale e maggiore riproducibilità^1. Tuttavia, non è noto se possano essere espansi e superati oltre lo stadio di sotto-ristrutturazione. Il nostro protocollo modificato mira ad affrontare questo problema passando i BMEC derivati da iPSC oltre il giorno 8 e valutando se possono essere ulteriormente ampliati per mantenere le proprietà BBB dopo la crioconservazione. Sebbene nessuno studio abbia descritto la passaging di BMEC derivati da iPSC, esiste un protocollo per la crioconservazione BMEC che mantiene proprietà fisiologiche BBB dopo aver subito un ciclo di congelamento-disgelo⁴⁰. Tuttavia, non è noto che i BMEC post-crioconservazione possano essere passaggi e mantenere le proprietà BBB.

I BPC derivati da iPSC che utilizzano il protocollo Lippmann sono stati utilizzati per modellare l’interruzione della BBB in disturbi neurologici come la malattia di Huntington⁷. Tali BMEC derivati da iPSC sono stati utilizzati anche per indagare gli effetti di infezioni batteriche come Neisseria meningitidis o Gruppo B Streptococcus sull’interruzione della barriera ematica-CSF e BBB^{rispettivamente 41,42}. Inoltre, utilizzando BMEC derivati da iPSC da pazienti con sindrome da cancellazione di 22q con schizofrenia, i ricercatori hanno osservato un aumento della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una delle principali molecole di adesione nei BMEC che aiutano con il reclutamento e l’estravasione dei leucociti^{nel cervello 43}. Nel loro insieme, questi studi dimostrano l’utilità di BMEC derivati dall’iPSC per lo studio dell’interruzione della BBB nei disturbi neuropsichiatrici complessi.