Summary

Neisseria meningitidis İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Endotel Hücrelerinin Enfeksiyonu

Published: July 14, 2020
doi:

Summary

Burada açıklanan protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı beyin benzeri endotel hücrelerinin ayırt edilmesinde, enfeksiyon için Neisseria meningitidis’in hazırlanmasında ve diğer moleküler analizler için numune toplanmasında ana adımları vurgulamaktadır.

Abstract

Meningokok menenjiti, Neisseria meningitidis (meningokok , Nm) son derece özelleşmiş beyin endotel hücrelerine (BEC’ler) nüfuz ederek merkezi sinir sistemine (CNS) erişebildiğinde ortaya çıkan hayatı tehdit eden bir enfeksiyondur. Nm insana özgü bir patojen olduğundan, sağlam in vivo model sistemlerinin olmaması, Nm ve BEC’ler arasındaki konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini zorlaştırmakta ve doğal BEC’leri taklit eden insan tabanlı bir modele ihtiyaç duyulmasını sağlamaktadır. BEC’ler, karmaşık sıkı bağlantılar ve yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) ile karakterize periferik endotel hücrelerine kıyasla daha sıkı bariyer özelliklerine sahiptir. Bununla birlikte, birincil BEC’ler ve ölümsüzleştirilmiş BEC’ler gibi birçok in vitro model, doğal nöral mikroçevreden çıkarıldıktan sonra bariyer özelliklerinden yoksundur veya hızla kaybeder. İnsan kök hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, diğer in vitro insan modellerine kıyasla fenoskopi BEC’lerini daha iyi hale getiren indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) beyin benzeri endotel hücreleri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. Nm-BEC etkileşimini modellemek için iPSC’den türetilen BEC’lerin (iPSC-BEC’ler) kullanılması, BEC bariyer özelliklerine sahip insan hücrelerini kullanma avantajına sahiptir ve bariyer yıkımını, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu ve bakteri etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Burada, bakteri preparasyonu, enfeksiyon ve analiz için numune toplamaya ek olarak iPSC’lerden iPSC-BEC’lerin nasıl türetileceğini gösteriyoruz.

Introduction

Kan-beyin bariyeri (BBB) ve meningeal kan-BOS bariyeri (mBCSFB), dolaşımı merkezi sinir sisteminden (CNS) ayıran ve esas olarak oldukça özelleşmiş beyin endotel hücrelerinden (BEC’ler) oluşan son derece sıkı hücresel bariyerlerdir1,2. Birlikte, BEC’ler birçok toksin, ilaç ve patojeni hariç tutarken, beynin içindeki ve dışındaki besinleri ve atık ürünleri düzenleyerek uygun beyin homeostazını korur 1,2. Bakteriyel menenjit, kan yoluyla bulaşan bakteriler BEC’lerle etkileşime girebildiğinde ve BEC’ler tarafından oluşturulan bariyere nüfuz edebildiğinde ve iltihaplanmaya neden olduğunda ortaya çıkar. Neisseria meningitidis (Nm, meningokok), sağlıklı bireylerin %10\u201240’ında nazofarenksi kolonize eden Gram negatif bir bakteridir, ancak bazı durumlarda ciddi sistemik hastalığa neden olabilir3. Etkilenen bireylerde Nm, purpura fulminans’a neden olabileceği kan dolaşımına erişebilir ve ayrıca menenjite neden olan CNS’ye erişim sağlayan BEC’lere nüfuz edebilir3. Nm, dünya çapında bakteriyel menenjitin önde gelen bir nedenidir ve aşılama çabalarına rağmen hala menenjitin birincil nedenidir4. Antibiyotik tedavisi gibi modern tıbbi müdahaleler bu koşulları hayatta kalmayı mümkün kılmıştır, ancak menenjitten etkilenenler genellikle kalıcı nörolojik hasarla kalmaktadır 5,6.

Önceki çalışmalar, Nm-BEC etkileşimlerinekatkıda bulunan bakteriyel faktörleri ve konakçı sinyallerini tanımlamıştır 7,8,9,10,11. Opaklık proteini Opc ve tip-IV pili gibi tanımlanan adhezinler ve invazinlerin yanı sıra CD147 gibi reseptörler, in vitro olarak çeşitli BEC modellerinde gerçekleştirilmiştir, ancak bu modeller birçok tanımlayıcı BBB özelliğinden yoksundur 7,9,11,12. Nm-BEC etkileşimlerinin tam olarak anlaşılması, kısmen in vivo modellerin kullanılamaması, eksik aşı koruması ve in vitro sağlam insan BEC modellerinin olmaması nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.

HCEC’lerin in vitro modellenmesi, BEC’lerin benzersiz özellikleri nedeniyle zor olmuştur. Periferik endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında, BEC’ler, karmaşık sıkı bağlantılar nedeniyle yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) gibi bariyer özelliklerini artıran bir dizi fenotipe sahiptir12. Beyin mikroçevresinden çıkarıldıktan sonra, BEC’ler, yalnızca zayıf bir bariyer oluşturan birincil veya ölümsüzleştirilmiş in vitro modellerin kullanışlılığını sınırlayan bariyer özelliklerini hızla kaybeder12,13. Nm enfeksiyonlarının insan özgüllüğü, sağlam in vivo modellerin eksikliği ve insan BEC’lerinin in vitro modellenmesindeki zorlukların birleşimi, Nm ve BEC’ler arasındaki karmaşık konakçı-patojen etkileşimini anlamak için daha iyi modellere ihtiyaç yaratır. Son zamanlarda, model insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojileri kullanılarak, BEC benzeri hücreler, in vivo BEC’leri daha iyi taklit eden iPSC’lerden türetilmiştir 12,13,14,15. iPSC-BEC’ler insan kökenlidir, kolayca ölçeklenebilir ve birincil veya ölümsüzleştirilmiş muadillerine kıyasla beklenen BEC fenotiplerine sahiptir12,13,14,15. Ek olarak, biz ve diğerleri, iPSC-BEC’lerin konak-patojen etkileşimi, Huntington hastalığı ve Allan-Hurndon-Dudley sendromuna neden olan MCT8 eksikliği gibi CNS’nin çeşitli hastalıklarını modellemek için yararlı olduğunu gösterdik 16,17,18,19,20,21. Burada, yenilenebilir iPSC kaynaklarından iPSC-BEC’lerin nasıl türetileceğini ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aktivasyonuna yol açan iPSC-BEC’lerin Nm ile enfeksiyonunun nasıl türetileceğini gösteriyoruz. Bu modelin, diğer in vitro modellerde özetlenemeyen konakçı-patojen etkileşimini sorgulamak için yararlı olduğuna ve özellikle Nm gibi insana özgü patojenlerle etkileşimleri incelerken yararlı olduğuna inanıyoruz.

Protocol

NOT: Tüm besiyeri / reaktif hazırlama, kök hücre bakımı ve farklılaşma adımları Stebbins ve ark.22’den uyarlanmıştır. 1. iPSC kültürü ve BEC farklılaşması için gerekli malzemelerin hazırlanması. IMR90-4 iPSC kültürü için doku kültürü (TC) plastiğinin matris kaplaması Aliquot bazal membran matris jeli (örn., Matrigel) 2.5 mg alikotlar halinde ve -20 ° C’de saklayın.NOT: 4 °C’nin üzerinde bir jel oluşturduğundan …

Representative Results

Burada açıklanan protokol Stebbins ve ark. ve iPSC’leri BBB özelliklerine sahip beyin benzeri endotel hücrelerine ayırma sürecini ve bu modelin Nm19,22 ile iPSC-BEC’leri kullanan enfeksiyon çalışmaları için nasıl kullanılacağını vurgulamaktadır. iPSC-BEC’ler, uygun şekilde farklılaştırıldığında, TEER tarafından ölçülen ve genellikle 2000 Ω·cm2’den büyük olan sıkı bariyer özellikleri sergiler ve VE-kaderin ve CD31 (PE…

Discussion

BEC’lerin ve BBB’nin modellenmesi, birincil ve ölümsüzleştirilmiş insan BEC’leri, in vitro olarak, sağlam bariyer fenotiplerinden yoksun olma eğiliminde olduğundan, zorluklar yaşamıştır. İnsan kök hücre teknolojilerinin ortaya çıkışı, endotelyal belirteçler, sıkı bağlantı ekspresyonu, bariyer özellikleri, diğer CNS hücre tiplerine yanıt ve fonksiyonel akış taşıyıcıları gibi beklenen ayırt edici BBB fenotiplerini koruyan iPSC’den türetilmiş BEC benzeri hücrelerin üretilmes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.M.E., A. S-U’ya verilen “İnsan Patojenleri Tarafından Mikrobiyal Enfeksiyonların İncelenmesi için 3D Doku Modelleri” başlıklı GRK2157 DFG araştırma eğitim programı tarafından desteklenmektedir. B.J.K., Alexander von Humboldt Vakfı tarafından doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Ek olarak, kültürde iPSC-BEC’lerin oluşturulmasındaki teknik yardımı için Lena Wolter’a teşekkür ederiz.

Materials

Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering – Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Play Video

Cite This Article
Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

View Video