Das hier beschriebene Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte bei der Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus gehirnähnlichen Endothelzellen, der Vorbereitung von Neisseria meningitidis auf eine Infektion und der Probenentnahme für andere molekulare Analysen.
Meningokokken-Meningitis ist eine lebensbedrohliche Infektion, die auftritt, wenn Neisseria meningitidis (Meningokokken, Nm) Zugang zum zentralen Nervensystem (ZNS) erlangen kann, indem sie in hochspezialisierte Gehirnendothelzellen (BECs) eindringt. Da es sich bei Nm um einen humanspezifischen Krankheitserreger handelt, macht der Mangel an robusten In-vivo-Modellsystemen die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen Nm und BECs schwierig und begründet die Notwendigkeit eines humanbasierten Modells, das native BECs nachahmt. BECs besitzen im Vergleich zu peripheren Endothelzellen, die durch komplexe Tight Junctions und einen erhöhten transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) gekennzeichnet sind, engere Barriereeigenschaften. Viele In-vitro-Modelle , wie z. B. primäre BECs und immortalisierte BECs, fehlen jedoch entweder oder verlieren schnell ihre Barriereeigenschaften, nachdem sie aus der nativen neuronalen Mikroumgebung entfernt wurden. Jüngste Fortschritte in der humanen Stammzelltechnologie haben Methoden zur Ableitung gehirnähnlicher Endothelzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) entwickelt, die BECs im Vergleich zu anderen In-vitro-Humanmodellen besser phänokopieren. Die Verwendung von iPSC-abgeleiteten BECs (iPSC-BECs) zur Modellierung der Nm-BEC-Interaktion hat den Vorteil, dass menschliche Zellen verwendet werden, die BEC-Barriereeigenschaften besitzen, und kann zur Untersuchung der Barrierezerstörung, der Aktivierung des angeborenen Immunsystems und der bakteriellen Interaktion verwendet werden. Hier zeigen wir, wie man iPSC-BECs aus iPS-Zellen ableiten kann, zusätzlich zur bakteriellen Vorbereitung, Infektion und Probenentnahme für die Analyse.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB) sind extrem dichte zelluläre Barrieren, die den Kreislauf vom zentralen Nervensystem (ZNS) trennen und hauptsächlich aus hochspezialisierten Gehirnendothelzellen (BECs) bestehen1,2. Zusammen sorgen BECs für eine ordnungsgemäße Homöostase des Gehirns, indem sie Nährstoffe und Abfallprodukte in und aus dem Gehirn regulieren und gleichzeitig viele Toxine, Medikamente und Krankheitserreger ausschließen 1,2. Eine bakterielle Meningitis tritt auf, wenn durch Blut übertragene Bakterien in der Lage sind, mit der von BECs gebildeten Barriere zu interagieren und diese zu durchdringen und Entzündungen zu verursachen. Neisseria meningitidis (Nm, Meningokokken) ist ein gramnegatives Bakterium, das den Nasenraum von 10 bis 40 % der gesunden Menschen besiedelt, aber in einigen Fällen schwere systemische Erkrankungen verursachen kann3. Bei betroffenen Personen kann Nm Zugang zum Blutkreislauf erhalten, wo es Purpura fulminans verursachen und in BECs eindringen kann, um Zugang zum ZNS zu erhalten, was zu Meningitisführt 3. Nm ist weltweit eine der Hauptursachen für bakterielle Meningitis und trotz Impfbemühungen immer noch eine der Hauptursachen für Meningitis4. Moderne medizinische Eingriffe, wie z. B. die Behandlung mit Antibiotika, haben diese Erkrankungen überlebensfähig gemacht, aber die Betroffenen mit Meningitis bleiben oft mit bleibenden neurologischen Schäden zurück 5,6.
Frühere Studien haben bakterielle Faktoren und Wirtssignale identifiziert, die zu Nm-BEC-Interaktionen beitragen 7,8,9,10,11. Die identifizierten Adhäsine und Invasine wie das Opazitätsprotein Opc und Typ-IV-Pili sowie Rezeptoren wie CD147 wurden an verschiedenen BEC-Modellen in vitro durchgeführt, diesen Modellen fehlen jedoch viele definierende BHS-Eigenschaften7,9,11,12. Ein vollständiges Verständnis der Nm-BEC-Wechselwirkungen ist nach wie vor schwer fassbar, was zum Teil auf die Unfähigkeit, In-vivo-Modelle zu verwenden, den unvollständigen Impfschutz und das Fehlen robuster menschlicher BEC-Modelle in vitro zurückzuführen ist.
Die Modellierung von hBECs in vitro war aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von BECs eine Herausforderung. Im Vergleich zu peripheren Endothelzellen weisen BECs eine Reihe von Phänotypen auf, die ihre Barriereeigenschaften verbessern, wie z. B. einen hohen transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) aufgrund komplexer Tight Junctions12. Einmal aus der Mikroumgebung des Gehirns entfernt, verlieren BECs schnell ihre Barriereeigenschaften, was die Nützlichkeit von primären oder immortalisierten In-vitro-Modellen, die nur eine schwache Barriere bilden, einschränkt12,13. Die Kombination aus der menschlichen Spezifität von Nm-Infektionen, dem Mangel an robusten In-vivo-Modellen und den Herausforderungen bei der Modellierung menschlicher BECs in vitro schafft einen Bedarf an besseren Modellen, um die komplexe Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen Nm und BECs zu verstehen. In jüngster Zeit wurden BEC-ähnliche Zellen aus iPS-Zellen abgeleitet, die BECs in vivo besser nachahmen 12,13,14,15. iPSC-BECs sind menschlichen Ursprungs, leicht skalierbar und besitzen im Vergleich zu ihren primären oder immortalisierten Gegenstücken die erwarteten BEC-Phänotypen12,13,14,15. Darüber hinaus haben wir und andere gezeigt, dass iPSC-BECs nützlich sind, um verschiedene Erkrankungen des ZNS zu modellieren, wie z.B. Wirt-Pathogen-Interaktion, Chorea Huntington und MCT8-Mangel, der das Allan-Hurndon-Dudley-Syndrom verursacht 16,17,18,19,20,21. In dieser Arbeit zeigen wir, wie iPSC-BECs aus erneuerbaren iPSC-Quellen abgeleitet werden können und wie die Infektion von iPSC-BECs mit Nm zur Aktivierung der angeborenen Immunantwort führt. Wir glauben, dass dieses Modell nützlich ist, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, die in anderen In-vitro-Modellen nicht rekapituliert werden können, und besonders nützlich ist, wenn Interaktionen mit humanspezifischen Krankheitserregern wie Nm untersucht werden.
Die Modellierung von BECs und der BHS war mit Herausforderungen verbunden, da primäre und immortalisierte humane BECs in vitro dazu neigen, robuste Barrierephänotypen zu vermissen. Das Aufkommen menschlicher Stammzelltechnologien hat die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten BEC-ähnlichen Zellen ermöglicht, die die erwarteten charakteristischen BHS-Phänotypen wie Endothelmarker, Tight-Junction-Expression, Barriereeigenschaften, Reaktion auf andere ZNS-Zelltypen und funktionelle Efflux-Transporter beibehalten 12,1…
The authors have nothing to disclose.
L.M.E. wird durch das DFG-Graduiertenkolleg GRK2157 “3D-Gewebemodelle zur Untersuchung mikrobieller Infektionen durch menschliche Pathogene” gefördert, das an A. S-U. B.J.K. wird durch ein Postdoktorandenstipendium der Alexander von Humboldt-Stiftung gefördert. Darüber hinaus danken wir Lena Wolter für ihre technische Unterstützung bei der Generierung der iPSC-BECs in Kultur.
Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzymatic cell dissociation reagent |
Acetic acid | Sigma | A6283 | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
Cell culture plates and flasks | Sarstedt | ||
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
Class II biosafety cabinet | Nuaire | NU-437-400E | |
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) | Corning | 3460, 3470 | |
D(+)-Glucose | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
DMSO | ROTH | A994.1 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | |
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
Kellogg's supplement | To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C. | ||
Knockout serum replacement (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA synthesis kit |
Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
Methanol | ROTH | 4627.5 | |
MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
Micropipettes (Research Plus) | Eppendorf | ||
NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
NucleoSpin RNA isolation kit | Machery-Nagel | 740955 | RNA isolation kit |
Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
Serological pipettes | Sarstedt | ||
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement | Gibco | A3349401 | Stem-cell maintenance medium |
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
Thiamine pyrophosphate | Sigma | C8754-5G | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Versene | Gibco | 15040-033 | Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA) |