Протокол, описанный здесь, освещает основные этапы дифференцировки индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток, полученных из стволовых клеток, подготовку Neisseria meningitidis к инфекции и сбор образцов для других молекулярных анализов.
Менингококковый менингит — это опасная для жизни инфекция, которая возникает, когда Neisseria meningitidis (meningococcus , Nm) может получить доступ к центральной нервной системе (ЦНС), проникая в высокоспециализированные эндотелиальные клетки головного мозга (БЭК). Поскольку Nm является патогеном, специфичным для человека, отсутствие надежных модельных систем in vivo затрудняет изучение взаимодействия между Nm и БЭК между патогеном-хозяином и устанавливает необходимость в модели, основанной на человеке, которая имитирует нативные БЭК. БЭК обладают более жесткими барьерными свойствами по сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, характеризующимися сложными плотными соединениями и повышенным трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TEER). Тем не менее, многие модели in vitro , такие как первичные БЭК и иммортализированные БЭК, либо отсутствуют, либо быстро теряют свои барьерные свойства после удаления из нативного нейронного микроокружения. Недавние достижения в технологиях стволовых клеток человека позволили разработать методы получения эндотелиальных клеток головного мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые лучше фенокопируют БЭК по сравнению с другими моделями человека in vitro . Использование БЭК, полученных из ИПСК (ИПСК-БЭК) для моделирования взаимодействия Nm-BEC, имеет преимущество использования клеток человека, обладающих барьерными свойствами BEC, и может быть использовано для изучения разрушения барьера, активации врожденного иммунитета и взаимодействия бактерий. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из ИПСК в дополнение к бактериальной подготовке, инфекции и сбору образцов для анализа.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и менингеальный гематоэнцефалический барьер (mBCSFB) представляют собой чрезвычайно плотные клеточные барьеры, которые отделяют кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) и в основном состоят из высокоспециализированных эндотелиальных клеток головного мозга (БЭК)1,2. Вместе БЭК поддерживают надлежащий гомеостаз мозга, регулируя поступление питательных веществ и продуктов жизнедеятельности в мозг и из него, исключая при этом многие токсины, лекарственные препараты и патогены 1,2. Бактериальный менингит возникает, когда бактерии, переносимые через кровь, способны взаимодействовать с барьером, образованным БЭК, и проникать через него, вызывая воспаление. Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) — грамотрицательная бактерия, которая колонизирует носоглотку у 10\u201240 % здоровых людей, но в некоторых случаях может вызывать серьезное системное заболевание3. У больных людей Nm может получить доступ к кровотоку, где он может вызвать молниеносную пурпуру, а также проникнуть в БЭК, получая доступ к ЦНС, вызывая менингит3. Нм является ведущей причиной бактериального менингита во всем мире и, несмотря на усилия по вакцинации, по-прежнему является основной причиной менингита4. Современные медицинские вмешательства, такие как лечение антибиотиками, сделали эти состояния жизнеспособными, однако люди, страдающие менингитом, часто остаются с необратимыми неврологическими повреждениями 5,6.
Предыдущие исследования идентифицировали бактериальные факторы и сигнализацию хозяина, которые способствуют взаимодействию Nm-BEC 7,8,9,10,11. Идентифицированные адгезины и инвазины, такие как белок непрозрачности Opc и pili IV типа, а также рецепторы, такие как CD147, были проведены на различных моделях BEC in vitro, однако в этих моделях отсутствуют многие определяющие свойства ГЭБ 7,9,11,12. Полное понимание взаимодействий Nm-BEC остается труднодостижимым отчасти из-за невозможности использования моделей in vivo, неполной защиты от вакцинации и отсутствия надежных моделей БЭК человека in vitro.
Моделирование hБЭК in vitro было сложной задачей из-за уникальных свойств БЭК. По сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, БЭК имеют ряд фенотипов, которые усиливают их барьерные свойства, такие как высокое трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) из-за сложных плотных соединений12. После удаления из микроокружения мозга БЭК быстро теряют свои барьерные свойства, ограничивая полезность первичных или иммортализированных моделей in vitro, которые образуют только слабый барьер12,13. Сочетание специфичности NM-инфекций для человека, отсутствия надежных моделей in vivo и проблем моделирования БЭК человека in vitro создает потребность в более совершенных моделях для понимания сложного взаимодействия между хозяином и патогеном между Nm и БЭК. В последнее время с использованием технологий модельных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) из ИПСК были получены БЭК-подобные клетки, которые лучше имитируют БЭК in vivo12,13,14,15. ИПСК-БЭК имеют человеческое происхождение, легко масштабируются и обладают ожидаемыми фенотипами БЭК по сравнению с их первичными или иммортализированными аналогами12,13,14,15. Кроме того, мы и другие ученые продемонстрировали, что ИПСК-БЭК полезны для моделирования различных заболеваний ЦНС, таких как взаимодействие патогена с хозяином, болезнь Хантингтона и дефицит MCT8, который вызывает синдром Аллана-Херндона-Дадли 16,17,18,19,20,21. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из возобновляемых источников ИПСК и инфекцию ИПСК-БЭК Nm, приводящую к активации врожденного иммунного ответа. Мы считаем, что эта модель полезна для изучения взаимодействия хозяина и патогена, которое не может быть воспроизведено в других моделях in vitro, и особенно полезна при изучении взаимодействий с патогенами, специфичными для человека, такими как Nm.
Моделирование БЭК и ГЭБ сопряжено с трудностями, поскольку первичные и иммортализированные человеческие БЭК in vitro, как правило, не имеют устойчивых барьерных фенотипов. Появление технологий стволовых клеток человека позволило получить БЭК-подобные клетки, полученные из ИПСК, кот?…
The authors have nothing to disclose.
L.M.E. поддерживается исследовательской учебной программой DFG GRK2157 под названием «3D-модели тканей для изучения микробных инфекций, вызванных патогенами человека», присужденной A. S-U. B.J.K. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Александра фон Гумбольдта. Кроме того, мы выражаем признательность Лене Уолтер за ее техническую помощь в создании ИПСК-БЭК в культуре.
Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzymatic cell dissociation reagent |
Acetic acid | Sigma | A6283 | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
Cell culture plates and flasks | Sarstedt | ||
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
Class II biosafety cabinet | Nuaire | NU-437-400E | |
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) | Corning | 3460, 3470 | |
D(+)-Glucose | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
DMSO | ROTH | A994.1 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | |
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
Kellogg's supplement | To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C. | ||
Knockout serum replacement (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA synthesis kit |
Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
Methanol | ROTH | 4627.5 | |
MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
Micropipettes (Research Plus) | Eppendorf | ||
NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
NucleoSpin RNA isolation kit | Machery-Nagel | 740955 | RNA isolation kit |
Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
Serological pipettes | Sarstedt | ||
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement | Gibco | A3349401 | Stem-cell maintenance medium |
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
Thiamine pyrophosphate | Sigma | C8754-5G | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Versene | Gibco | 15040-033 | Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA) |