Summary

Neisseria meningitidis Инфекция индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток головного мозга

Published: July 14, 2020
doi:

Summary

Протокол, описанный здесь, освещает основные этапы дифференцировки индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток, полученных из стволовых клеток, подготовку Neisseria meningitidis к инфекции и сбор образцов для других молекулярных анализов.

Abstract

Менингококковый менингит — это опасная для жизни инфекция, которая возникает, когда Neisseria meningitidis (meningococcus , Nm) может получить доступ к центральной нервной системе (ЦНС), проникая в высокоспециализированные эндотелиальные клетки головного мозга (БЭК). Поскольку Nm является патогеном, специфичным для человека, отсутствие надежных модельных систем in vivo затрудняет изучение взаимодействия между Nm и БЭК между патогеном-хозяином и устанавливает необходимость в модели, основанной на человеке, которая имитирует нативные БЭК. БЭК обладают более жесткими барьерными свойствами по сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, характеризующимися сложными плотными соединениями и повышенным трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TEER). Тем не менее, многие модели in vitro , такие как первичные БЭК и иммортализированные БЭК, либо отсутствуют, либо быстро теряют свои барьерные свойства после удаления из нативного нейронного микроокружения. Недавние достижения в технологиях стволовых клеток человека позволили разработать методы получения эндотелиальных клеток головного мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые лучше фенокопируют БЭК по сравнению с другими моделями человека in vitro . Использование БЭК, полученных из ИПСК (ИПСК-БЭК) для моделирования взаимодействия Nm-BEC, имеет преимущество использования клеток человека, обладающих барьерными свойствами BEC, и может быть использовано для изучения разрушения барьера, активации врожденного иммунитета и взаимодействия бактерий. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из ИПСК в дополнение к бактериальной подготовке, инфекции и сбору образцов для анализа.

Introduction

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и менингеальный гематоэнцефалический барьер (mBCSFB) представляют собой чрезвычайно плотные клеточные барьеры, которые отделяют кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) и в основном состоят из высокоспециализированных эндотелиальных клеток головного мозга (БЭК)1,2. Вместе БЭК поддерживают надлежащий гомеостаз мозга, регулируя поступление питательных веществ и продуктов жизнедеятельности в мозг и из него, исключая при этом многие токсины, лекарственные препараты и патогены 1,2. Бактериальный менингит возникает, когда бактерии, переносимые через кровь, способны взаимодействовать с барьером, образованным БЭК, и проникать через него, вызывая воспаление. Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) — грамотрицательная бактерия, которая колонизирует носоглотку у 10\u201240 % здоровых людей, но в некоторых случаях может вызывать серьезное системное заболевание3. У больных людей Nm может получить доступ к кровотоку, где он может вызвать молниеносную пурпуру, а также проникнуть в БЭК, получая доступ к ЦНС, вызывая менингит3. Нм является ведущей причиной бактериального менингита во всем мире и, несмотря на усилия по вакцинации, по-прежнему является основной причиной менингита4. Современные медицинские вмешательства, такие как лечение антибиотиками, сделали эти состояния жизнеспособными, однако люди, страдающие менингитом, часто остаются с необратимыми неврологическими повреждениями 5,6.

Предыдущие исследования идентифицировали бактериальные факторы и сигнализацию хозяина, которые способствуют взаимодействию Nm-BEC 7,8,9,10,11. Идентифицированные адгезины и инвазины, такие как белок непрозрачности Opc и pili IV типа, а также рецепторы, такие как CD147, были проведены на различных моделях BEC in vitro, однако в этих моделях отсутствуют многие определяющие свойства ГЭБ 7,9,11,12. Полное понимание взаимодействий Nm-BEC остается труднодостижимым отчасти из-за невозможности использования моделей in vivo, неполной защиты от вакцинации и отсутствия надежных моделей БЭК человека in vitro.

Моделирование hБЭК in vitro было сложной задачей из-за уникальных свойств БЭК. По сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, БЭК имеют ряд фенотипов, которые усиливают их барьерные свойства, такие как высокое трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) из-за сложных плотных соединений12. После удаления из микроокружения мозга БЭК быстро теряют свои барьерные свойства, ограничивая полезность первичных или иммортализированных моделей in vitro, которые образуют только слабый барьер12,13. Сочетание специфичности NM-инфекций для человека, отсутствия надежных моделей in vivo и проблем моделирования БЭК человека in vitro создает потребность в более совершенных моделях для понимания сложного взаимодействия между хозяином и патогеном между Nm и БЭК. В последнее время с использованием технологий модельных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) из ИПСК были получены БЭК-подобные клетки, которые лучше имитируют БЭК in vivo12,13,14,15. ИПСК-БЭК имеют человеческое происхождение, легко масштабируются и обладают ожидаемыми фенотипами БЭК по сравнению с их первичными или иммортализированными аналогами12,13,14,15. Кроме того, мы и другие ученые продемонстрировали, что ИПСК-БЭК полезны для моделирования различных заболеваний ЦНС, таких как взаимодействие патогена с хозяином, болезнь Хантингтона и дефицит MCT8, который вызывает синдром Аллана-Херндона-Дадли 16,17,18,19,20,21. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из возобновляемых источников ИПСК и инфекцию ИПСК-БЭК Nm, приводящую к активации врожденного иммунного ответа. Мы считаем, что эта модель полезна для изучения взаимодействия хозяина и патогена, которое не может быть воспроизведено в других моделях in vitro, и особенно полезна при изучении взаимодействий с патогенами, специфичными для человека, такими как Nm.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы приготовления сред / реагентов, поддержания стволовых клеток и дифференцировки адаптированы из Stebbins et al.22. 1. Подготовка материалов, необходимых для культивирования ИПСК и дифференциации БЭК. Матричное покрытие пластика для культу…

Representative Results

Протокол, описанный здесь, адаптирован из Stebbins et al. и освещает процесс дифференцировки ИПСК в эндотелиальные клетки мозга, обладающие свойствами ГЭБ, а также то, как использовать эту модель для исследований инфекций с использованием ИПСК-БЭК с Nm19,22. При пр…

Discussion

Моделирование БЭК и ГЭБ сопряжено с трудностями, поскольку первичные и иммортализированные человеческие БЭК in vitro, как правило, не имеют устойчивых барьерных фенотипов. Появление технологий стволовых клеток человека позволило получить БЭК-подобные клетки, полученные из ИПСК, кот?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.M.E. поддерживается исследовательской учебной программой DFG GRK2157 под названием «3D-модели тканей для изучения микробных инфекций, вызванных патогенами человека», присужденной A. S-U. B.J.K. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Александра фон Гумбольдта. Кроме того, мы выражаем признательность Лене Уолтер за ее техническую помощь в создании ИПСК-БЭК в культуре.

Materials

Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering – Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Play Video

Cite This Article
Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

View Video