Summary

Neisseria meningitidis Infección de células endoteliales cerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas

Published: July 14, 2020
doi:

Summary

El protocolo descrito aquí destaca los principales pasos en la diferenciación de células madre pluripotentes derivadas de células madre cerebrales inducidas, la preparación de Neisseria meningitidis para la infección y la recolección de muestras para otros análisis moleculares.

Abstract

La meningitis meningocócica es una infección potencialmente mortal que se produce cuando Neisseria meningitidis (meningococo , Nm) puede acceder al sistema nervioso central (SNC) penetrando en las células endoteliales cerebrales (BEC) altamente especializadas. Dado que el Nm es un patógeno específico del ser humano, la falta de sistemas modelo in vivo robustos dificulta el estudio de las interacciones huésped-patógeno entre el Nm y los BEC y establece la necesidad de un modelo basado en el ser humano que imite a los BEC nativos. Las BEC poseen propiedades de barrera más ajustadas en comparación con las células endoteliales periféricas caracterizadas por uniones estrechas complejas y una elevada resistencia eléctrica transendotelial (TEER). Sin embargo, muchos modelos in vitro , como los BEC primarios y los BEC inmortalizados, carecen o pierden rápidamente sus propiedades de barrera después de la eliminación del microambiente neural nativo. Los avances recientes en las tecnologías de células madre humanas han desarrollado métodos para derivar células endoteliales similares al cerebro a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que fenocopian mejor las BEC en comparación con otros modelos humanos in vitro . El uso de BEC derivadas de iPSC (iPSC-BEC) para modelar la interacción Nm-BEC tiene la ventaja de utilizar células humanas que poseen propiedades de barrera BEC y puede utilizarse para examinar la destrucción de la barrera, la activación inmunitaria innata y la interacción bacteriana. Aquí demostramos cómo derivar iPSC-BEC a partir de iPSC, además de la preparación bacteriana, la infección y la recolección de muestras para su análisis.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BHE) y la barrera hematoencefálica meníngea (mBCSFB) son barreras celulares extremadamente estrechas que separan la circulación del sistema nervioso central (SNC) y están compuestas principalmente por células endoteliales cerebrales (BEC) altamente especializadas1,2. Juntos, los BEC mantienen una homeostasis cerebral adecuada mediante la regulación de nutrientes y productos de desecho dentro y fuera del cerebro, al tiempo que excluyen muchas toxinas, medicamentos y patógenos 1,2. La meningitis bacteriana se produce cuando las bacterias transmitidas por la sangre son capaces de interactuar y penetrar en la barrera formada por los BEC y causar inflamación. Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) es una bacteria gramnegativa que coloniza la nasofaringe del 10-40 % de los individuos sanos, pero en algunos casos puede causar enfermedades sistémicas graves3. En los individuos afectados, el Nm puede acceder al torrente sanguíneo donde puede causar púrpura fulminante, así como penetrar en los BEC que acceden al SNC causando meningitis3. La NM es una de las principales causas de meningitis bacteriana en todo el mundo y, a pesar de los esfuerzos de vacunación, sigue siendo una de las principales causas de meningitis4. Las intervenciones médicas modernas, como el tratamiento con antibióticos, han hecho que estas condiciones sean superables, sin embargo, los afectados por meningitis a menudo quedan con daño neurológico permanente 5,6.

Estudios previos han identificado factores bacterianos y la señalización del huésped que contribuyen a las interacciones Nm-BEC 7,8,9,10,11. Las adhesinas e invasinas identificadas, como la proteína de opacidad Opc y los pili tipo IV, así como receptores como CD147, se han realizado en varios modelos BEC in vitro, sin embargo, estos modelos carecen de muchas propiedades definitorias de la BHE 7,9,11,12. La comprensión completa de las interacciones Nm-BEC sigue siendo difícil de alcanzar debido en parte a la incapacidad de utilizar modelos in vivo, la protección incompleta de la vacunación y la falta de modelos BEC humanos robustos in vitro.

El modelado de hBEC in vitro ha sido un reto debido a las propiedades únicas de los BEC. En comparación con las células endoteliales periféricas, las BEC tienen una serie de fenotipos que mejoran sus propiedades de barrera, como la alta resistencia eléctrica transendotelial (TEER) debido a las uniones estrechas complejas12. Una vez removidos del microambiente cerebral, los BEC pierden rápidamente sus propiedades de barrera, lo que limita la utilidad de los modelos primarios o inmortalizados in vitro que solo forman una barrera débil12,13. La combinación de la especificidad humana de las infecciones por Nm, la falta de modelos in vivo robustos y los desafíos para modelar BEC humanos in vitro crea la necesidad de mejores modelos para comprender la compleja interacción huésped-patógeno entre Nm y BEC. Recientemente, utilizando tecnologías modelo de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), se han derivado células similares a BEC a partir de iPSC que imitan mejor a las BEC in vivo12,13,14,15. Las iPSC-BEC son de origen humano, fácilmente escalables y poseen fenotipos BEC esperados en comparación con sus contrapartes primarias o inmortalizadas12,13,14,15. Además, nosotros y otros hemos demostrado que las iPSC-BEC son útiles para modelar diversas enfermedades del SNC, como la interacción huésped-patógeno, la enfermedad de Huntington y la deficiencia de MCT8 que causa el síndrome de Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Aquí, demostramos cómo derivar iPSC-BEC a partir de fuentes renovables de iPSC y la infección de iPSC-BEC con Nm que conduce a la activación de la respuesta inmune innata. Creemos que este modelo es útil para interrogar la interacción huésped-patógeno que no se puede recapitular en otros modelos in vitro y es especialmente útil cuando se examinan las interacciones con patógenos específicos humanos como Nm.

Protocol

NOTA: Todos los pasos de preparación de medios/reactivos, mantenimiento de células madre y diferenciación son una adaptación de Stebbins et al.22. 1. Preparación de los materiales necesarios para el cultivo de iPSC y la diferenciación de BEC. Recubrimiento matricial de plástico de cultivo de tejidos (TC) para cultivo IMR90-4 iPSCGel de matriz de membrana basal alícuota (p. ej., Matrigel) en alícuotas de 2,5 mg y almacenar a -20 °C.NOTA: T…

Representative Results

El protocolo descrito aquí es una adaptación de Stebbins et al. y destaca el proceso para diferenciar las iPSC en células endoteliales similares al cerebro que poseen propiedades de BBB, y cómo utilizar este modelo para estudios de infección utilizando iPSC-BEC con Nm19,22. Las iPSC-BECs, cuando se diferencian adecuadamente, exhiben propiedades de barrera ajustadas medidas por TEER que a menudo son mayores de 2000 Ω·cm2, y expresan marcadores en…

Discussion

El modelado de BECs y la BBB ha tenido desafíos, ya que los BECs humanos primarios e inmortalizados, in vitro, tienden a carecer de fenotipos de barrera robustos. El advenimiento de las tecnologías de células madre humanas ha permitido la generación de células similares a BEC derivadas de iPSC que conservan los fenotipos característicos esperados de la BBB, como los marcadores endoteliales, la expresión de la unión estrecha, las propiedades de barrera, la respuesta a otros tipos de células del SNC y los…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.M.E. cuenta con el apoyo del programa de formación en investigación de DFG GRK2157 titulado “Modelos de tejidos 3D para el estudio de infecciones microbianas por patógenos humanos” otorgado a A. S-U. B.J.K. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación Alexander von Humboldt. Además, reconocemos a Lena Wolter por su asistencia técnica en la generación de los iPSC-BEC en cultura.

Materials

Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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