Summary

Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Published: July 14, 2020
doi:

Summary

Il protocollo qui descritto evidenzia i principali passaggi nella differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, nella preparazione di Neisseria meningitidis per l’infezione e nella raccolta di campioni per altre analisi molecolari.

Abstract

La meningite meningococcica è un’infezione pericolosa per la vita che si verifica quando Neisseria meningitidis (meningococco , Nm) può accedere al sistema nervoso centrale (SNC) penetrando nelle cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate. Poiché Nm è un patogeno specifico per l’uomo, la mancanza di solidi sistemi modello in vivo rende difficile lo studio delle interazioni ospite-patogeno tra Nm e BEC e stabilisce la necessità di un modello basato sull’uomo che imiti i BEC nativi. I BEC possiedono proprietà di barriera più strette rispetto alle cellule endoteliali periferiche caratterizzate da complesse giunzioni strette e da un’elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER). Tuttavia, molti modelli in vitro , come i BEC primari e i BEC immortalizzati, mancano o perdono rapidamente le loro proprietà di barriera dopo la rimozione dal microambiente neurale nativo. I recenti progressi nelle tecnologie delle cellule staminali umane hanno sviluppato metodi per derivare cellule endoteliali simili al cervello da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che fenopiano meglio le BEC rispetto ad altri modelli umani in vitro . L’uso di BEC derivati da iPSC (IPSC-BEC) per modellare l’interazione Nm-BEC ha il vantaggio di utilizzare cellule umane che possiedono proprietà di barriera BEC e può essere utilizzato per esaminare la distruzione della barriera, l’attivazione immunitaria innata e l’interazione batterica. Qui dimostriamo come derivare le iPSC-BEC dalle iPSC oltre alla preparazione batterica, all’infezione e alla raccolta del campione per l’analisi.

Introduction

La barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera meningea sangue-liquido cerebrospinale (mBCSFB) sono barriere cellulari estremamente strette che separano la circolazione dal sistema nervoso centrale (SNC) e sono costituite principalmente da cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate1,2. Insieme, i BEC mantengono una corretta omeostasi cerebrale regolando i nutrienti e i prodotti di scarto dentro e fuori il cervello, escludendo molte tossine, farmaci e agenti patogeni 1,2. La meningite batterica si verifica quando i batteri trasmissibili per via ematica sono in grado di interagire e penetrare la barriera formata dai BEC e causare infiammazione. Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è un batterio Gram-negativo che colonizza il rinofaringe del 10-40% degli individui sani, ma in alcuni casi può causare gravi malattie sistemiche3. Negli individui affetti, Nm può ottenere l’accesso al flusso sanguigno dove può causare porpora fulminante e penetrare i BEC ottenendo l’accesso al SNC causando la meningite3. La NM è una delle principali cause di meningite batterica in tutto il mondo e, nonostante gli sforzi di vaccinazione, è ancora una delle cause primarie di meningite4. L’intervento medico moderno, come il trattamento antibiotico, ha reso queste condizioni sopravvissute, tuttavia le persone colpite da meningite spesso rimangono con danni neurologici permanenti 5,6.

Studi precedenti hanno identificato i fattori batterici e la segnalazione dell’ospite che contribuiscono alle interazioni Nm-BEC 7,8,9,10,11. Le adesine e le invasine identificate, come la proteina di opacità Opc e i pili di tipo IV, così come i recettori come CD147, sono stati condotti su vari modelli BEC in vitro, tuttavia questi modelli mancano di molte proprietà di definizione della BBB 7,9,11,12. La comprensione completa delle interazioni Nm-BEC rimane elusiva a causa in parte dell’incapacità di utilizzare modelli in vivo, della protezione vaccinale incompleta e della mancanza di robusti modelli BEC umani in vitro.

La modellazione degli hBEC in vitro è stata impegnativa a causa delle proprietà uniche dei BEC. Rispetto alle cellule endoteliali periferiche, le BEC hanno una serie di fenotipi che migliorano le loro proprietà di barriera, come l’elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) dovuta a complesse giunzioni strette12. Una volta rimossi dal microambiente cerebrale, i BEC perdono rapidamente le loro proprietà di barriera, limitando l’utilità di modelli primari o immortalizzati in vitro che formano solo una debole barriera12,13. La combinazione della specificità umana delle infezioni da NM, la mancanza di robusti modelli in vivo e le sfide che modellano i BEC umani in vitro crea la necessità di modelli migliori per comprendere la complessa interazione ospite-patogeno tra Nm e BAC. Recentemente, utilizzando tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) modello, le cellule simili a BEC sono state derivate da iPSC che imitano meglio le BEC in vivo12,13,14,15. Le iPSC-BEC sono di origine umana, facilmente scalabili e possiedono i fenotipi BEC attesi rispetto alle loro controparti primarie o immortalizzate12,13,14,15. Inoltre, noi e altri abbiamo dimostrato che le iPSC-BEC sono utili per modellare varie malattie del SNC come l’interazione ospite-patogeno, la malattia di Huntington e il deficit di MCT8 che causa la sindromedi Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Qui, dimostriamo come derivare le iPSC-BEC da fonti rinnovabili di iPSC e l’infezione delle iPSC-BEC con Nm che porta all’attivazione della risposta immunitaria innata. Riteniamo che questo modello sia utile per interrogare l’interazione ospite-patogeno che non può essere ricapitolata in altri modelli in vitro ed è particolarmente utile quando si esaminano le interazioni con patogeni specifici per l’uomo come il Nm.

Protocol

NOTA: Tutte le fasi di preparazione del terreno/reagente, del mantenimento delle cellule staminali e della differenziazione sono adattate da Stebbins et al.22. 1. Preparazione dei materiali necessari per la coltura delle iPSC e il differenziamento delle BEC. Rivestimento della matrice della plastica per coltura tissutale (TC) per coltura iPSC IMR90-4Aliquote di gel di matrice di membrana basale (ad es. Matrigel) in aliquote da 2,5 mg e conservare a -20…

Representative Results

Il protocollo qui descritto è adattato da Stebbins et al. ed evidenzia il processo per differenziare le iPSC in cellule endoteliali simili al cervello che possiedono proprietà BBB e come utilizzare questo modello per gli studi di infezione utilizzando iPSC-BEC con Nm19,22. Le iPSC-BEC, se differenziate correttamente, mostrano proprietà di barriera strette misurate da TEER che sono spesso superiori a 2000 Ω·cm2 ed esprimono marcatori endoteliali co…

Discussion

La modellazione dei BEC e della BBB ha avuto delle sfide, poiché i BEC umani primari e immortalizzati, in vitro, tendono a mancare di fenotipi di barriera robusti. L’avvento delle tecnologie delle cellule staminali umane ha permesso la generazione di cellule BEC derivate da iPSC che mantengono i fenotipi tipici della BBB come i marcatori endoteliali, l’espressione della giunzione stretta, le proprietà di barriera, la risposta ad altri tipi di cellule del SNC e i trasportatori funzionali dell’efflusso 12,13,14,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.M.E. è supportato dal programma di formazione alla ricerca DFG GRK2157 dal titolo “3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens” assegnato ad A.S-U. B.J.K. è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Alexander von Humboldt. Inoltre, ringraziamo Lena Wolter per la sua assistenza tecnica nella generazione delle iPSC-BEC in cultura.

Materials

Accutase (1x) Sigma A6964 Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid Sigma A6283
All-trans retinoic acid (RA) Sigma R2625
Anti-CD31 (PECAM-1) Thermo Scientific (Labvision) RB-10333
Anti-Claudin-5 Invitrogen 4C3C2
Anti-Glut-1 Thermo Scientific (Labvision) SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin Invitrogen 33-1500
Anti-VE-cadherin Santa Cruz sc-52751
Anti-ZO-1 Invitrogen 33-9100
Bacto Proteose Peptone BD 211684
b-Mercaptoethanol Merck (Sigma-Aldrich) 805740
Cell culture plates and flasks Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet Nuaire NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) Nuaire
Collagen IV Sigma C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood Biomerieux 43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) Corning 3460, 3470
D(+)-Glucose Merck (Sigma-Aldrich) G8270
DAPI Invitrogen D1306
DMEM/F12 Gibco 31330-038
DMSO ROTH A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode Merck (Millipore) MERS00002
Fe(NO3)3 ROTH 5632.1
Fibronectin Sigma F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) Nikon
Hemacytometer (Neubauer) A. Hartenstein ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) PeproTech 100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Gibco 11111-044
Inverted microscope (Wilovert) Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells WiCell
Kellogg's supplement To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR) Gibco 10828-028
L-glutamine (GlutaMAX) Invitrogen 35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010L cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix Corning 354230
Methanol ROTH 4627.5
MgCl2 ROTH KK36.1
Micropipettes (Research Plus) Eppendorf
NaHCO3 ROTH 6329
Nonessential amino acids (NEAA) Gibco 11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit Machery-Nagel 740955 RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro) Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) Fisher 50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25742 qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) Applied Biosystems 4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) Applied Biosystems 4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride Tocris 1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) Applied Biosystems 4376600
Serological pipettes Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement Gibco A3349401 Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate Sigma C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Versene Gibco 15040-033 Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

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Endres, L. M., Hathcock, S. F., Schubert-Unkmeir, A., Kim, B. J. Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (161), e61400, doi:10.3791/61400 (2020).

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