Le protocole décrit ici met en évidence les principales étapes de la différenciation des cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites, de la préparation de Neisseria meningitidis pour l’infection et de la collecte d’échantillons pour d’autres analyses moléculaires.
La méningite à méningocoques est une infection potentiellement mortelle qui survient lorsque Neisseria meningitidis (méningocoque, Nm) peut accéder au système nerveux central (SNC) en pénétrant dans des cellules endothéliales cérébrales (CEB) hautement spécialisées. Comme le Nm est un agent pathogène spécifique à l’homme, l’absence de systèmes modèles in vivo robustes rend difficile l’étude des interactions hôte-pathogène entre le Nm et les BEC et établit la nécessité d’un modèle humain qui imite les BEC natifs. Les BEC possèdent des propriétés de barrière plus serrées que les cellules endothéliales périphériques caractérisées par des jonctions serrées complexes et une résistance électrique trans-endothéliale (TEER) élevée. Cependant, de nombreux modèles in vitro , tels que les BEC primaires et les BEC immortalisés, n’ont pas ou perdent rapidement leurs propriétés de barrière après avoir été retirés du microenvironnement neuronal natif. Les progrès récents dans les technologies des cellules souches humaines ont permis de mettre au point des méthodes permettant de dériver des cellules endothéliales semblables à celles du cerveau à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) qui permettent de mieux faire une phénocopie des BEC par rapport à d’autres modèles humains in vitro . L’utilisation de BEC dérivés d’iPSC (iPSC-BEC) pour modéliser l’interaction Nm-BEC présente l’avantage d’utiliser des cellules humaines qui possèdent des propriétés de barrière BEC et peut être utilisée pour examiner la destruction de la barrière, l’activation immunitaire innée et l’interaction bactérienne. Nous montrons ici comment dériver des iPSC-BEC à partir d’iPSCs en plus de la préparation bactérienne, de l’infection et de la collecte d’échantillons pour analyse.
La barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière méningée-sang-LCR (mBCSFB) sont des barrières cellulaires extrêmement serrées qui séparent la circulation du système nerveux central (SNC) et sont principalement composées de cellules endothéliales cérébrales (CEB) hautement spécialisées1,2. Ensemble, les BEC maintiennent une bonne homéostasie cérébrale en régulant les nutriments et les déchets à l’intérieur et à l’extérieur du cerveau, tout en excluant de nombreuses toxines, médicaments et agents pathogènes 1,2. La méningite bactérienne survient lorsque les bactéries transmissibles par le sang sont capables d’interagir avec la barrière formée par les BEC et de la pénétrer, ce qui provoque une inflammation. Neisseria meningitidis (Nm, méningocoque) est une bactérie à Gram négatif qui colonise le nasopharaynx de 10 à 40 % des individus en bonne santé, mais qui, dans certains cas, peut provoquer une maladie systémique grave3. Chez les personnes atteintes, le Nm peut accéder à la circulation sanguine où il peut provoquer un purpura fulminans ainsi que pénétrer dans les BEC en accédant au SNC causant la méningite3. Le Nm est l’une des principales causes de méningite bactérienne dans le monde et, malgré les efforts de vaccination, reste l’une des principales causes de méningite4. Les interventions médicales modernes, telles que les traitements antibiotiques, ont permis de survivre à ces maladies, mais les personnes atteintes de méningite se retrouvent souvent avec des dommages neurologiques permanents 5,6.
Des études antérieures ont identifié des facteurs bactériens et la signalisation de l’hôte qui contribuent aux interactions Nm-BEC 7,8,9,10,11. Les adhésines et les invasines identifiées telles que la protéine d’opacité Opc et les pili de type IV, ainsi que des récepteurs tels que CD147, ont été menées sur divers modèles BEC in vitro, mais ces modèles manquent de nombreuses propriétés BHEdéfinissant 7,9,11,12. La compréhension complète des interactions Nm-BEC reste difficile à atteindre, en partie à cause de l’incapacité d’utiliser des modèles in vivo, d’une protection vaccinale incomplète et du manque de modèles BEC humains robustes in vitro.
La modélisation des hBEC in vitro a été difficile en raison des propriétés uniques des BEC. Par rapport aux cellules endothéliales périphériques, les BEC présentent un certain nombre de phénotypes qui améliorent leurs propriétés de barrière, telles qu’une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER) due à des jonctions serrées complexes12. Une fois retirés du microenvironnement cérébral, les BEC perdent rapidement leurs propriétés barrières, ce qui limite l’utilité des modèles primaires ou in vitro immortalisés qui ne forment qu’une barrière faible12,13. La combinaison de la spécificité humaine des infections à Nm, de l’absence de modèles in vivo robustes et des défis liés à la modélisation des BEC humains in vitro crée un besoin de meilleurs modèles pour comprendre l’interaction complexe hôte-pathogène entre Nm et les BEC. Récemment, à l’aide de technologies modèles de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), des cellules de type BEC ont été dérivées de cellules iPS qui imitent mieux les BEC in vivo12,13,14,15. Les iPSC-BEC sont d’origine humaine, facilement évolutives et possèdent les phénotypes BEC attendus par rapport à leurs homologues primaires ou immortalisés12,13,14,15. De plus, nous et d’autres avons démontré que les iPSC-BEC sont utiles pour modéliser diverses maladies du SNC telles que l’interaction hôte-pathogène, la maladie de Huntington et le déficit en MCT8 qui cause le syndrome d’Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21. Ici, nous montrons comment dériver des iPSC-BEC à partir de sources d’iPSC renouvelables et l’infection des iPSC-BEC par Nm conduisant à l’activation de la réponse immunitaire innée. Nous pensons que ce modèle est utile pour interroger l’interaction hôte-pathogène qui ne peut pas être récapitulée dans d’autres modèles in vitro et est particulièrement utile lors de l’examen des interactions avec des agents pathogènes spécifiques à l’homme tels que Nm.
La modélisation des BEC et de la BHE a posé des défis, car les BEC humains primaires et immortalisés, in vitro, ont tendance à ne pas avoir de phénotypes barrières robustes. L’avènement des technologies de cellules souches humaines a permis la génération de cellules de type BEC dérivées de CSPi qui conservent les phénotypes de BHE caractéristiques attendus, tels que les marqueurs endothéliaux, l’expression des jonctions serrées, les propriétés barrières, la réponse à d’autres types de …
The authors have nothing to disclose.
L.M.E. est soutenu par le programme de formation à la recherche de la DFG GRK2157 intitulé « Modèles tissulaires 3D pour l’étude des infections microbiennes par des agents pathogènes humains » attribué à A. S-U. B.J.K. bénéficie d’une bourse postdoctorale de la Fondation Alexander von Humboldt. De plus, nous remercions Lena Wolter pour son assistance technique dans la génération des iPSC-BEC dans le domaine de la culture.
Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzymatic cell dissociation reagent |
Acetic acid | Sigma | A6283 | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
Cell culture plates and flasks | Sarstedt | ||
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
Class II biosafety cabinet | Nuaire | NU-437-400E | |
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) | Corning | 3460, 3470 | |
D(+)-Glucose | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
DMSO | ROTH | A994.1 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | |
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
Kellogg's supplement | To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C. | ||
Knockout serum replacement (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA synthesis kit |
Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
Methanol | ROTH | 4627.5 | |
MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
Micropipettes (Research Plus) | Eppendorf | ||
NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
NucleoSpin RNA isolation kit | Machery-Nagel | 740955 | RNA isolation kit |
Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
Serological pipettes | Sarstedt | ||
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement | Gibco | A3349401 | Stem-cell maintenance medium |
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
Thiamine pyrophosphate | Sigma | C8754-5G | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Versene | Gibco | 15040-033 | Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA) |