Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Polimikrobiyal topluluklar doğada yaygındır, çevre çeşitli kapsayan^1,2,3 ve insan nişler^4,5. İnsan hastalığında en kötü üne sahip polimikrobiyal enfeksiyonların bazıları diş biyofilmleri^{içerir 6}, kronik yaralar^7,8, ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı olan bireylerde solunum yolu enfeksiyonları⁹, ventilatör ilişkili pnömoni¹⁰, ve genetik hastalık kistik fibrozis (CF)^11,12. Bu enfeksiyonlar genellikle çeşitli mikrobiyal türlerden oluşur; Ancak, Gram-pozitif bakteri Staphylococcus aureus ve Gram-negatif bakteri Pseudomonas aeruginosa arasındaki etkileşimleri yeni bir odak ortaya çıkmıştır. Bu organizmalarla birlikte enfekte olmuş ve in vitro analizleri içeren çalışmalar, hastalığın ilerlemesi, mikrobiyal sağkalım, virülans, metabolizma ve antibiyotik duyarlılığı üzerinde derin ve beklenmeyen etkilere sahip olabilecek rekabetçi ve işbirliğine dayalı etkileşimleri ortaya koymaktadır (Hotterbeekx ve ark. 2017¹³ ve Limoli ve Hoffman 2019³tarafından ayrıntılı olarak incelenmiştir).

Enfeksiyon sırasında türler arası etkileşimlere olan ilginin artması, polimikrobiyal topluluk davranışlarını incelemek için çeşitli yöntemler ortaya koymuştur. Tipik olarak, bu çalışmalar monokültür ve coculture arasındaki henotik farklılıkları araştırmak için plaka veya et suyu bazlı tahliller yararlanmış. Örneğin, katı yüzeylerde P. aeruginosa ve S. aureus koculturing büyüme inhibisyonu veya koloni fenotip, pigment veya polisakkarit üretimi^14,,15,16değişiklikler görselleştirme için izin verdi. Karışık türler biyofilmler, biyotik veya abiyotik yüzeylerde, yanı sıra sıvı kültüründe bakteri türlerinin koculturing de büyüme değişiklikleri ölçümü sağlamıştır, metabolizma, antibiyotik tolerans, rekabet ve canlılık, gen ve protein ekspresyonuna ek olarak^17,18. Bu toplu kültür deneyleri P. aeruginosa ve S. aureus’un toplum ölçeğinde birbirlerini nasıl etkileyebileceklerine dair içgörüler ortaya çıkarmış olsa da, tek hücre düzeyinde gerçekleşen etkileşimler hakkında önemli soruları cevaplayamamaktadırlar. Burada sunulan yöntem, zaman içinde bir topluluk içinde tek hücrelerin hareket, hücre canlılığı ve gen ekspresyonundaki değişikliklere odaklanarak türler arası etkileşimleri inceleme yaklaşımlarına katkıda bulunur.

Tek hücreli etkileşimler, hücrelerin toplu topluluğunda gerçekleşen etkileşimlerden büyük ölçüde farklı olabilir. Tek hücreli analiz yoluyla, bir topluluk içindeki heterojenlik, hücrelerin mekansal yerleşiminin toplum dinamiklerini nasıl etkilediğini veya bir grubun bireysel üyeleri içinde gen ve protein ekspresyon düzeylerinin nasıl değiştiğini incelemek için ölçülebilir. İzleme hücreleri, tek hücrelerin birden fazla nesil boyunca zaman içinde nasıl hareket edip nasıl hareket ettigini de içgörü sağlayabilir. Hücre hareketini ve gen ekspresyonundaki değişiklikleri eş zamanlı olarak izleyerek gen dalgalanmaları ile buna karşılık gelen fenotipler arasında korelasyonlar yapılabilir. Tek hücredüzeyinde tek tek bakteri türlerinin incelenmesi için önceki protokoller tanımlanmıştır. Bu çalışmalar tek bir düzlemde zaman içinde canlı görüntüleme hücrelerinin yararlanmak, ve hücre bölünmesi ve antibiyotik duyarlılık gibi fenotipler gözlemlemek için yararlı olmuştur^19,20. Ek canlı görüntüleme mikroskopisi büyüme, hareketlilik, yüzey kolonizasyonu ve tek bakteri türlerinin biyofilm^oluşumunuizlemek için kullanılmıştır 21^,22,23. Ancak, bu çalışmalar monokültürde bakterilerin fizyolojisini anlamak için anlayışlı olmakla birlikte, coculture zaman içinde birden fazla bakteri türünün tek hücreli davranışgözlem için deneyler sınırlıdır.

Burada, tek türgörüntüleme için kullanılan önceki protokoller P. aeruginosa ve S. aureusarasındaki etkileşimleri incelemek için uyarlanmıştır. Bu organizmalar hücre morfolojilerine göre faz kontrastı altında ayırt edilebilirler(P. aeruginosa basilli, S. aureus ise kokidir). Bu yöntemin geliştirilmesi son zamanlarda S. aureus²⁴varlığında P. aeruginosa daha önce tanımlanmamış hareketlilik davranışlarının görselleştirilmesi sağladı. P. aeruginosa’nın S. aureus’u uzaktan algılama ve S. aureus hücre kümelerine doğru artan ve yönlü tek hücreli hareketlerle yanıt verme yeteneğine sahip olduğu bulunmuştur. S. aureus doğru P. aeruginosa hareketi tip IV pili gerektiren bulundu (TFP), koordine uzantısı ve geri çekme seğirme hareketliliği denilen bir hareket oluşturmak saç benzeri projeksiyonlar²⁵.

Bu çalışmalar türler arasındaki daha önceki etkileşimleri sorgulamak için bu yöntemin yararını göstermektedir. Ancak, daha sonraki etkileşim zaman noktalarında yüksek hücre yoğunluklarında görüntüleme, daha sonra tek hücre tabakalarının tanımlanamayacağı göz önüne alındığında zordur ve bu da çoğunlukla görüntüleme sonrası analiz sırasında sorunlara yol açabilir. Bu sınırlama göz önüne alındığında, yöntem daha sonra daha sonraki etkileşimleri temsil eden yüksek hücre yoğunlukları temsilcisi geleneksel makroskopik tahliller ile takip edilebilir önceki etkileşimler için en uygundur. Bu yöntemin ek sınırlamaları düşük iş bölümü doğasını içerir, çünkü bir seferde yalnızca bir örnek görüntülenebilir ve mikroskop, kamera ve çevre odasının maliyeti. Ayrıca floresan mikroskopisi fototoksisite ve fotobeyaztma gibi bakteri hücreleri için risk oluşturur, bu nedenle floresan görüntülerin elde edilebilir sıklığını sınırlayan. Son olarak, bu yöntemde kullanılan agarose pedleri, koşullar doğru değilse pedleri küçültmeye veya genişletmeye başlayabilir göz önüne alındığında, sıcaklık ve nem gibi koşulları kontrol etmek için kritik hale, ortamdaki değişikliklere son derece duyarlıdır. Son olarak, bu yöntem ana ortam taklit etmez iken, farklı bakteri türlerinin yüzeylerde nasıl tepki ipuçları sağlar, hangi çevresel / konak koşulları taklit etmek için tasarlanmış tahlillerde takip edilebilir.

Bu yöntem, tek hücreli hareketi takip eden önceki çalışmalardan farklıdır, bu hücreler bir coverslip ve agarose ped arasında aşılanmış, yüzeyhücreleri kısıtlayan. Bu, hücre izlemenin tek bir düzlemde zaman içinde izlenmesini sağlar; ancak, hücreler sıvı^26’yabatırıldığında gözlenen geçici yüzey etkileşimdöngülerini sınırlar. Bir agarose ped altında görüntüleme bakterilerin bir diğer yararı klasik P. aeruginosa seğirme motilite²⁵incelemek için kullanılan makroskopik plaka tabanlı yüzey altı inogülasyon tahlilleri taklit olmasıdır. Bu testte, bakteri hücreleri petri kabının alt kısmı ile agar arasında aşılanır, bu mikroskop protokolü gibi, kabın alt kısmından dışa doğru hareket ederken hücreleri tek bir düzlemde tutarlar.

Burada sunulan türler arası etkileşimleri görselleştirmek için hızlandırılmış mikroskopi protokolü 1) bakteri örneği ve agarose pedinhazırlanması, 2) görüntüleme edinimi için mikroskop ayarlarının seçilmesi ve 3) görüntüleme sonrası analizden oluşur. Hücre hareketinin ve takibinin ayrıntılı görselleştirilmesi, faz kontrastı ile kısa zaman aralıklarında görüntülerin elde edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Floresan mikroskopisi de zaman içinde hücre canlılığını veya gen ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir. Burada, floresan mikroskobu için adaptasyon bir örnek agarose pedleri için canlılık boyaları eklenmesi ile göstermektedir.