التصور الحركي لتفاعلات البكتيريا بين الخلايا المفردة

المجتمعات متعددة الميكروبات شائعة في الطبيعة، وتمتد على مجموعة متنوعة من البيئية^1و2و3 و المنافذ البشرية^4،5. بعض من التهابات بوليكروبات الأكثر شهرة في الأمراض البشرية وتشمل الأغشية الحيوية الأسنان⁶, الجروح المزمنة^7,8, والتهابات الجهاز التنفسي في الأفراد الذين يعانون من مرض الانسداد الرئوي المزمن⁹, التنفس الصناعي المرتبطة الالتهاب الرئوي¹⁰, والتليف الكيسي المرض الوراثي (CF)^11,12. وغالبا ما تتكون هذه العدوى من أنواع ميكروبية متنوعة. ومع ذلك، فقد برز تركيز حديث على التفاعلات بين البكتيريا المكورات العنقودية الأوريوسية الإيجابية للجرام وبكتيريا Pseudomonas aeruginosa السلبية للجرام. وتكشف الدراسات التي تشمل المرضى المصابين بهذه الكائنات الحية والتحليلات المختبرية عن التفاعلات التنافسية والتعاونية التي يمكن أن يكون لها تأثيرات عميقة وغير متوقعة على تطور المرض، والبقاء على قيد الحياة الميكروبي، والفوعة، والتمثيل الغذائي، وقابلية المضادات الحيوية (استعرضت بالتفصيل من قبل ثيرتبيكيكس وآخرون 2017¹³ وليمولي وهوفمان 2019³).

وقد أدى الاهتمام المتزايد في التفاعلات بين الأنواع أثناء العدوى إلى مجموعة متنوعة من الطرق لدراسة سلوكيات المجتمع متعدد الميكروبات. عادة، استخدمت هذه الدراسات الوحايس القائمة على لوحة أو مرق للتحقيق في الاختلافات الظاهري بين الزراعة الأحادية وتربية التكث. على سبيل المثال، coculturing P. aeruginosa وS. aureus على الأسطح الصلبة سمحت للتصور من تثبيط النمو أو التغيرات في النمط الظاهري مستعمرة، الصباغ، أو إنتاج السكريات^14،15،16. الأنواع الحيوية المختلطة، على الأسطح الحيوية أو اللاأحيائية، وكذلك الأنواع البكتيرية coculturing في الثقافة السائلة كما مكن قياس التغيرات في النمو، والتمثيل الغذائي، والتسامح المضادات الحيوية، والمنافسة والاستمرارية، بالإضافة إلى الجينات والبروتين التعبير^17،18. في حين كشفت هذه التجارب الثقافة السائبة نظرة ثاقبة كيف P. aeruginosa وS. aureus قد تؤثر على بعضها البعض على نطاق المجتمع, أنها غير قادرة على الإجابة على أسئلة هامة حول التفاعلات التي تحدث على مستوى خلية واحدة. الأسلوب المعروض هنا يضيف إلى نهج لدراسة التفاعلات بين الأنواع من خلال التركيز على التغيرات في الحركة، وقابلية الخلية للحياة، والتعبير الجيني للخلايا الفردية داخل مجتمع مشترك مع مرور الوقت.

يمكن أن تختلف التفاعلات أحادية الخلية بشكل كبير عن التفاعلات التي تحدث في مجتمع الخلايا السائبة. ومن خلال التحليل أحادي الخلية، يمكن قياس التغايرية داخل المجتمع المحلي كمياً لدراسة كيفية تأثير الموضع المكاني للخلايا على ديناميات المجتمع المحلي أو كيف تتغير مستويات التعبير الجيني والبروتيني داخل فرادى أعضاء المجموعة. يمكن أن توفر خلايا التتبع أيضًا نظرة ثاقبة على كيفية تحرك الخلايا الفردية وسلوكها بمرور الوقت ، من خلال أجيال متعددة. من خلال تتبع حركة الخلايا والتغيرات في التعبير الجيني في وقت واحد، يمكن إجراء الارتباطات بين تقلبات الجينات والأنماط الظاهرية المقابلة. وقد تم وصف البروتوكولات السابقة لدراسة الأنواع البكتيرية الفردية على مستوى الخلية الواحدة. هذه الدراسات الاستفادة من خلايا التصوير الحي مع مرور الوقت في مستوى واحد، وكانت مفيدة لمراقبة الأنماط الظاهرية مثل انقسام الخلايا والمضادات الحيوية التعرض^19,20. وقد استخدمت إضافية المجهر التصوير الحي لرصد النمو، والحركة، واستعممار السطح وتشكيل بيو فيلم من الأنواع البكتيرية واحدة^21،22،23. ومع ذلك ، في حين أن هذه الدراسات كانت ثاقبة لفهم فسيولوجيا البكتيريا في الزراعة الأحادية ، فإن تجارب مراقبة سلوك الخلايا الواحدة لأنواع بكتيرية متعددة مع مرور الوقت في الزراعة المشتركة محدودة.

هنا، تم تكييف البروتوكولات السابقة المستخدمة للتصوير من نوع واحد لدراسة التفاعلات بين P. aeruginosa وS. aureus. ويمكن تمييز هذه الكائنات تحت النقيض من المرحلة على أساس morphologies الخلية(P. aeruginosa هي عصيات وS. aureus هي cocci). تطوير هذا الأسلوب مؤخرا تمكين التصور من السلوكيات الحركة غير الموصوفة سابقا من P. aeruginosa في وجود S. aureus²⁴. P. aeruginosa وجد أن تكون قادرة على استشعار S. aureus من مسافة بعيدة والاستجابة مع زيادة واتجاه حركات خلية واحدة نحو مجموعات من الخلايا S. aureus. P. aeruginosa الحركة نحو S. aureus وجدت أن تتطلب نوع الرابع بيلي (TFP), الشعر مثل التوقعات التي تمديد منسقة والتراجع توليد حركة تسمى الارتعاش²⁵حركة .

وتبين هذه الدراسات فائدة هذه الطريقة لاستجواب التفاعلات السابقة بين الأنواع. ومع ذلك، فإن التصوير بكثافة الخلايا العالية عند نقاط وقت التفاعل اللاحقة أمر صعب بالنظر إلى أنه لم يعد من الممكن تحديد طبقات واحدة من الخلايا، مما يطرح في الغالب مشكلات أثناء تحليل ما بعد التصوير. وبالنظر إلى هذا القيد، فإن الطريقة هي الأنسب للتفاعلات في وقت سابق التي يمكن بعد ذلك متابعة مع المقايسات العيانية التقليدية في أعلى كثافات الخلية ممثلة للتفاعلات في وقت لاحق. وتشمل القيود الإضافية لهذه الطريقة طبيعة منخفضة الإنتاجية، حيث يمكن تصوير عينة واحدة فقط في كل مرة وتكلفة المجهر والكاميرا وغرفة البيئة. وعلاوة على ذلك، يشكل المجهر الفلوري مخاطر على الخلايا البكتيرية مثل السمية الضوئية وphotobleaching، وبالتالي الحد من التردد الذي يمكن الحصول على الصور الفلورية. وأخيراً، فإن منصات الأاغروز المستخدمة في هذه الطريقة معرضة بشدة للتغيرات في البيئة، مما يجعل من الأهمية بمكان التحكم في ظروف مثل درجة الحرارة والرطوبة، بالنظر إلى أن الوسادات يمكن أن تبدأ في الانكماش أو التوسع إذا كانت الظروف غير صحيحة. وأخيراً، في حين أن هذه الطريقة لا تحاكي البيئة المضيفة، إلا أنها توفر أدلة حول كيفية استجابة الأنواع البكتيرية المختلفة على الأسطح، والتي يمكن متابعتها في مقايسات مصممة لمحاكاة الظروف البيئية/المضيفة.

هذه الطريقة تختلف عن الدراسات السابقة تتبع حركة الخلية المفردة، في أن يتم تلقيح الخلايا بين غطاء و لوحة agarose، تقييد الخلايا إلى السطح. وهذا يتيح تتبع الخلايا عبر الوقت في مستوى واحد; ومع ذلك، يحد من دورات الاشتباك السطحي العابر لوحظ عندما يتم غمر الخلايا في السائل²⁶. فائدة إضافية من البكتيريا التصوير تحت لوحة agarose هو أنه يحاكي المجهرية لوحة على أساس اختبار تحت السطح يستخدم كلاسيكيا لفحص P. aeruginosa ارتعاش²⁵حركة . في هذا الفحص ، يتم تلقيح الخلايا البكتيرية بين الجزء السفلي من طبق بيتري والأجار ، مع الحفاظ على الخلايا في مستوى واحد أثناء تحركها عبر الجزء السفلي من الطبق إلى الخارج من نقطة التطعيم ، مثل بروتوكول المجهر هذا.

بروتوكول المجهر الفاصل الزمني لتصور التفاعلات بين الأنواع المعروضة هنا يتكون من 1) إعداد عينة بكتيرية و وسادة agarose، 2) اختيار إعدادات المجهر للحصول على التصوير و 3) بعد التصوير التحليل. ويمكن تنفيذ تصور مفصل لحركة الخلية وتتبعها عن طريق الحصول على الصور على فترات زمنية قصيرة من قبل النقيض من المرحلة. ويمكن أيضا أن تستخدم المجهر الفلوريس لتحديد صلاحية الخلية أو التعبير الجيني مع مرور الوقت. هنا، نعرض مثالاً واحداً على التكيف مع المجهر المفلور من خلال إضافة الأصباغ الصالحة للحياة إلى منصات agarose.