הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

קהילות פולימיקרוביאליות נפוצות בטבע, המשתרעות על פני מגוון רחב של^{איכות הסביבה 1,,2,,3 ונישות אנושיות 4,,5}. חלק מהזיהומים הפולימיקרוביאליים הידועים לשמצה ביותר במחלה האנושית כוללים ביופילם^{דנטלי 6},^{פצעים כרוניים 7,}8 ,^{וזיהומים}בדרכי הנשימה באנשים עם מחלת^{ריאות חסימתית כרונית 9}, דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה¹⁰, ואת המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF)^11,12. זיהומים אלה מורכבים לעתים קרובות של מינים מיקרוביאליים מגוונים; עם זאת, לאחרונה להתמקד באינטראקציות בין החיידק גראם חיובי Staphylococcus aureus ואת החיידק גראם שלילי פסאודומונס aeruginosa הגיח. מחקרים הכוללים חולים הנגועים באורגניזמים אלה וניתוחים במבחנה חושפים הן אינטראקציות תחרותיות והן אינטראקציות שיתופיות שיכולות להיות השפעות עמוקות ובלתי צפויות על התקדמות המחלה, הישרדות מיקרוביאלית, ויריות, חילוף חומרים, ורגישות^{לאנטיביוטיקה (נבדק}בפירוט על ידי Hotterbeekx ואח ‘. 2017¹³ ו לימולי והופמן 2019 3 ).

העניין הגובר באינטראקציות בין מינים במהלך הזיהום הניב מגוון שיטות לחקר התנהגויות קהילתיות פולמיקרוביאליות. בדרך כלל, מחקרים אלה השתמשו צלחת או מבוסס מרק ים כדי לחקור את ההבדלים פנוטיפיים בין monoculture וcoculture. לדוגמה, coculturing P. aeruginosa ו S. aureus על משטחים מוצקים אפשרה הדמיה של עיכוב צמיחה או שינויים בפנוטיפ המושבה, פיגמנט, או פוליסכריד^{ייצור 14,15,16}. מינים מעורבים biofilms, על משטחים ביוטיים או abiotic, כמו גם coculturing מינים חיידקיים בתרבות נוזלית גם אפשר מדידה של שינויים בצמיחה, חילוף החומרים, סובלנות לאנטיביוטיקה, תחרות וכדאיות, בנוסף^{לביטוי גנים וחלבון 17,18}. בעוד ניסויי תרבות בתפזורת אלה חשפו תובנה כיצד P. aeruginosa ו S. aureus עשויים להשפיע אחד על השני בקנה מידה קהילתי, הם אינם מסוגלים לענות על שאלות חשובות על האינטראקציות המתקיימות ברמה של תא יחיד. השיטה המוצגת כאן מוסיפה לגישות לחקר אינטראקציות בין-מינים על ידי התמקדות בשינויים בתנועה, בכדאיות התא ובביטוי הגנים של תאים בודדים בתוך קהילה מקוטפת לאורך זמן.

אינטראקציות של תאים בודדים עשויות להיות שונות באופן נרחב מהאינטראקציות המתקיימות בקהילה בתפזורת של תאים. באמצעות ניתוח של תאים בודדים, ניתן לכמת הטרוגניות בתוך קהילה כדי ללמוד כיצד מיקום מרחבי של תאים משפיע על הדינמיקה הקהילתית או כיצד רמות ביטוי גנים וחלבונים משתנות בתוך חברים בודדים בקבוצה. תאי מעקב יכולים גם לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים בודדים נעים ומתנהגים לאורך זמן, דרך דורות מרובים. על ידי מעקב אחר תנועת תאים ושינויים בביטוי גנים בו זמנית, ניתן לבצע מתאם בין תנודות גנים ופנוטיפים מתאימים. פרוטוקולים קודמים לחקר מינים חיידקיים בודדים ברמת תא אחד תוארו. מחקרים אלה לנצל את תאי הדמיה חיים לאורך זמן במטוס אחד, היו שימושיים להתבוננות פנוטיפים כמו חלוקת תאים^{ורגישות אנטיביוטית 19,20}. מיקרוסקופ הדמיה חיה נוספת נוצלה כדי לפקח על צמיחה, תנועה, קולוניזציה פני השטח היווצרות biofilm של מינים חיידקיים יחיד^21,22,23. עם זאת, בעוד מחקרים אלה היו תובנה להבנת הפיזיולוגיה של חיידקים במונוקולטורה, ניסויים להתבוננות בהתנהגות חד-תאית של מינים חיידקיים מרובים לאורך זמן coculture מוגבלים.

כאן, פרוטוקולים קודמים המשמשים להדמיה חד-מינית הותאמו לאינטראקציות מחקר בין P. aeruginosa ו S. aureus. אורגניזמים אלה ניתן להבדיל תחת ניגודיות שלב בהתבסס על מורפולוגיות התא שלהם(P. aeruginosa הם bacilli ו S. aureus הם cocci). פיתוח שיטה זו אפשר לאחרונה את ההדמיה של התנהגויות תנועתיות שלא ייחסנו בעבר של P. aeruginosa בנוכחות S. aureus²⁴. P. aeruginosa נמצא מסוגל לחוש S. aureus ממרחק ולהגיב עם תנועות מוגברות וכיוון תא יחיד כלפי אשכולות של S. aureus תאים. P. aeruginosa תנועה לכיוון S. aureus נמצא לדרוש את הסוג IV pili (TFP), תחזיות כמו שיער אשר הארכה מתואמת ונסיגה ליצור תנועה הנקראת תנועתיות עוויתות²⁵.

מחקרים אלה מדגימים את התועלת של שיטה זו לחקר אינטראקציות קודמות בין מינים. עם זאת, הדמיה בצפיפות תאים גבוהה בנקודות זמן אינטראקציה מאוחרת יותר קשה בהתחשב בכך ששכבות בודדות של תאים כבר לא ניתן לזהות, אשר בעיקר מציב בעיות במהלך ניתוח שלאחר הדמיה. בהינתן מגבלה זו, השיטה מתאימה ביותר לאינטראקציות קודמות שניתן היה לעקוב אחריהן עם בדיקות מאקרו-סקופיות מסורתיות בצפיפות תאים גבוהה יותר המייצגות אינטראקציות מאוחרות יותר. מגבלות נוספות של שיטה זו כוללות את אופי התפוקה הנמוכה, שכן רק מדגם אחד ניתן למצוא בכל פעם ואת העלות של מיקרוסקופ, מצלמה, ותא סביבתי. יתר על כן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מהווה סיכונים לתאים חיידקיים כמו פוטוטוקסיסיטי ופוטו-בליבקינג, ולכן מגביל את התדירות שניתן לרכוש תמונות פלואורסצנטיות. לבסוף, רפידות agarose בשימוש בשיטה זו רגישים מאוד לשינויים בסביבה, מה שהופך אותו קריטי כדי לשלוט בתנאים כמו טמפרטורה ולחות, בהתחשב בכך רפידות יכול להתחיל להתכווץ או להרחיב אם התנאים אינם נכונים. לבסוף, בעוד שיטה זו אינה מחקה את הסביבה המארחת, היא מספקת רמזים כיצד מינים חיידקיים שונים מגיבים על משטחים, אשר ניתן לעקוב אחר בהם בתרופות שנועדו לחקות תנאים סביבתיים/מארחים.

שיטה זו שונה ממחקרים קודמים מעקב אחר תנועת תא יחיד, כי תאים מחוסנים בין כיסוי כרית agarose, הגבלת תאים אל פני השטח. הדבר מאפשר מעקב אחר תאים לאורך זמן במטוס יחיד; עם זאת, מגביל מחזורים של מעורבות משטח ארעי שנצפו כאשר תאים שקועים בנוזל²⁶. יתרון נוסף של חיידקים הדמיה תחת כרית agarose הוא כי הוא מחקה את החיסון מבוסס צלחת מאקרוסקופית תת משטח אומר קלאסי משמש כדי לבחון P. aeruginosa עוויתות^{תנוענות 25}. בהסכם זה, תאים חיידקיים מחוסנים בין החלק התחתון של צלחת פטרי ואת agar, שמירה על התאים במטוס אחד כפי שהם נעים על פני החלק התחתון של הצלחת כלפי חוץ מנקודת של חיסונים, ממש כמו פרוטוקול מיקרוסקופי זה.

פרוטוקול מיקרוסקופ זמן לשגות להדמיה אינטראקציות בין מינים המוצגים כאן מורכב 1) הכנת מדגם חיידקים וpad agarose, 2) בחירת הגדרות מיקרוסקופ עבור רכישת הדמיה 3) ניתוח שלאחר הדמיה. הדמיה מפורטת של תנועת תאים ומעקב יכולה להתבצע על ידי רכישת תמונות במרווחי זמן קצרים לפי ניגודיות שלב. מיקרוסקופ פלואורסץ יכול גם להיות מנוצל כדי לקבוע את הכדאיות של תאים או ביטוי גנים לאורך זמן. כאן, אנו מציגים דוגמה אחת של הסתגלות למיקרוסקופ פלואורסנצטי באמצעות תוספת של צבעי כדאיות רפידות agarose.