Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Polymicrobiële gemeenschappen komen vaak voor in de natuur, verspreid over een verscheidenheid van^milieu-1,2,3 en menselijke niches^4,5. Enkele van de meest beruchte polymicrobiële infecties bij menselijke ziekte zijn tandheelkundige biofilms⁶, chronische wonden^7,8, en luchtweginfecties bij personen met chronische obstructieve longziekte⁹, beademingsgerelateerde longontsteking¹⁰, en de genetische ziekte cystische fibrose (CF)^11,12. Deze infecties bestaan vaak uit diverse microbiële soorten; echter, een recente focus op de interacties tussen de Gram-positieve bacterie Staphylococcus aureus en de Gram-negatieve bacterie Pseudomonas aeruginosa is ontstaan. Studies met inbegrip van patiënten die met deze organismen zijn besmet en in vitro-analyses onthullen zowel concurrerende als coöperatieve interacties die diepgaande en onverwachte invloeden kunnen hebben op de progressie van de ziekte, microbiële overleving, virulentie, metabolisme en antibioticagevoeligheid (in detail beoordeeld door Hotterbeekx et al. 2017¹³ en Limoli en Hoffman 2019³).

De groeiende interesse in interspecies interacties tijdens infectie heeft een verscheidenheid aan methoden opgeleverd voor het bestuderen van polymicrobiële gemeenschap gedrag. Typisch, deze studies hebben gebruikt plaat of bouillon-gebaseerde tests om de fenotypische verschillen tussen monocultuur en cocultuur te onderzoeken. Bijvoorbeeld, coculturing P. aeruginosa en S. aureus op vaste oppervlakken heeft toegestaan voor visualisatie van groeiremming of veranderingen in kolonie fenotype, pigment, of polysaccharide productie^14,15,16. Gemengde soorten biofilms, op biotische of abiotische oppervlakken, evenals het coculeren van bacteriële soorten in vloeibare cultuur heeft het ook mogelijk gemaakt meting van veranderingen in groei, metabolisme, antibioticatolerantie, concurrentie en levensvatbaarheid, naast gen- en eiwitexpressie^17,18. Hoewel deze bulkcultuurexperimenten inzicht hebben verwezen in hoe P. aeruginosa en S. aureus elkaar op gemeenschapsschaal zouden kunnen beïnvloeden, zijn ze niet in staat om belangrijke vragen te beantwoorden over de interacties die plaatsvinden op eencellig niveau. De hier gepresenteerde methode draagt bij aan de benaderingen voor het bestuderen van interspecies interacties door zich te concentreren op de veranderingen in beweging, cel levensvatbaarheid, en genexpressie van enkele cellen binnen een cocultured gemeenschap in de tijd.

Single-cell interacties kunnen sterk verschillen van de interacties die plaatsvinden in een bulk gemeenschap van cellen. Door middel van eencellige analyse kan heterogeniteit binnen een gemeenschap worden gekwantificeerd om te bestuderen hoe ruimtelijke plaatsing van cellen de dynamiek van de gemeenschap beïnvloedt of hoe gen- en eiwitexpressieniveaus veranderen binnen individuele leden van een groep. Het bijhouden van cellen kan ook inzicht geven in hoe afzonderlijke cellen zich in de loop van de tijd bewegen en zich gedragen, door meerdere generaties heen. Door het gelijktijdig bijhouden van celbeweging en veranderingen in genexpressie, kunnen correlaties worden gemaakt tussen genschommelingen en overeenkomstige fenotypen. Eerdere protocollen voor het bestuderen van individuele bacteriële soorten op eencellig niveau zijn beschreven. Deze studies maken gebruik van live-imaging cellen in de tijd in een enkel vlak, en zijn nuttig geweest voor het observeren van fenotypes zoals celdeling en antibiotica gevoeligheid^19,20. Extra live-imaging microscopie is gebruikt om de groei, beweeglijkheid, oppervlaktekolonisatie en biofilmvorming van enkele bacteriële soorten^21,22,23te monitoren . Echter, terwijl deze studies zijn inzichtelijk voor het begrijpen van de fysiologie van bacteriën in monocultuur, experimenten voor het observeren van eencellige gedrag van meerdere bacteriële soorten na verloop van tijd in cocultuur zijn beperkt.

Hier zijn eerdere protocollen die worden gebruikt voor beeldvorming met één soort aangepast om de interacties tussen P. aeruginosa en S. aureuste bestuderen. Deze organismen kunnen onder fasecontrast worden onderscheiden op basis van hun celmorfologieën(P. aeruginosa zijn bacillen en S. aureus zijn cocci). De ontwikkeling van deze methode maakte onlangs de visualisatie van eerder onbeschreven beweeglijkheidsgedrag van P. aeruginosa in aanwezigheid van S. aureus²⁴mogelijk . P. aeruginosa bleek S. aureus van een afstand te kunnen waarmaken en te reageren met verhoogde en directionele eencellige bewegingen naar clusters van S. aureus-cellen. P. aeruginosa beweging naar S. aureus bleek het type IV pili (TFP), haar-achtige projecties waarvan de gecoördineerde uitbreiding en intrekking genereren een beweging genaamd trillende beweeglijkheid²⁵vereisen .

Deze studies tonen het nut van deze methode voor het ondervragen van eerdere interacties tussen soorten. Beeldvorming bij hoge celdichtheden op latere interactietijdpunten is echter moeilijk, aangezien afzonderlijke lagen cellen niet meer kunnen worden geïdentificeerd, wat meestal problemen oplevert tijdens analyse na de beeldvorming. Gezien deze beperking is de methode het meest geschikt voor eerdere interacties die vervolgens kunnen worden opgevolgd met traditionele macroscopische tests bij hogere celdichtheden die representatief zijn voor latere interacties. Bijkomende beperkingen van deze methode zijn de lage doorvoer, omdat slechts één monster tegelijk kan worden afgebeeld en de kosten van de microscoop, camera en milieukamer. Bovendien vormt fluorescentiemicroscopie risico’s voor de bacteriële cellen zoals fototoxiciteit en fotobleaching, waardoor de frequentie wordt beperkt dat fluorescentiebeelden kunnen worden verkregen. Ten slotte zijn de agarosepads die bij deze methode worden gebruikt zeer gevoelig voor veranderingen in de omgeving, waardoor het van cruciaal belang is om te controleren op omstandigheden zoals temperatuur en vochtigheid, gezien het feit dat de pads kunnen beginnen te krimpen of uit te breiden als de omstandigheden niet correct zijn. Ten slotte, terwijl deze methode niet na te bootsen de gastheer omgeving, het biedt aanwijzingen voor hoe verschillende bacteriële soorten reageren op oppervlakken, die kunnen worden opgevolgd in tests ontworpen om milieu / gastheer voorwaarden na te bootsen.

Deze methode verschilt van eerdere studies bijhouden van eencellige beweging, in die zin dat cellen worden ingeënt tussen een coverslip en agarose pad, beperking van cellen aan het oppervlak. Dit maakt celtracking na verloop van tijd in één vlak mogelijk; beperkt echter cycli van tijdelijke oppervlaktebetrokkenheid waargenomen wanneer cellen worden ondergedompeld in vloeistof²⁶. Een bijkomend voordeel van beeldvorming bacteriën onder een agarose pad is dat het bootst macroscopische plaat-gebaseerde sub-oppervlakte inenting testen klassiek gebruikt om P. aeruginosa trillende beweeglijkheid²⁵onderzoeken . In deze test worden bacteriële cellen ingeënt tussen de bodem van een petrischaaltje en de agar, waardoor de cellen in één vlak blijven terwijl ze over de bodem van de schotel naar buiten bewegen vanaf het punt van inenting, net als dit microscopieprotocol.

De time-lapse microscopie protocol voor het visualiseren van interspecies interacties hier gepresenteerd bestaat uit 1) de voorbereiding van de bacteriële monster en agarose pad, 2) het selecteren van microscoop instellingen voor imaging acquisitie en 3) post-imaging analyse. Gedetailleerde visualisatie van celbeweging en tracking kan worden uitgevoerd door het verwerven van beelden op korte tijdsintervallen op fasecontrast. Fluorescentie microscopie kan ook worden gebruikt om cel levensvatbaarheid of genexpressie te bepalen na verloop van tijd. Hier tonen we een voorbeeld van aanpassing voor fluorescentie microscopie door de toevoeging van levensvatbaarheid kleurstoffen aan de agarose pads.