Кинетическая визуализация одноклеточных межвидовые бактериальные взаимодействия

Полимикробные сообщества распространены в природе,^{охватывающих различные экологические 1,,2,,3} и^{человеческие ниши 4,,5.} Некоторые из самых известных полимикробных инфекций в болезни^{человека включают стоматологические биопленки 6},^{хронические раны 7,8}, и респираторных инфекций у лиц с хронической^{обструктивной болезнью легких 9}, аппарат^{искусственной вентиляции легких пневмонии 10}, и генетическое заболевание муковисцидоз (CF)^11,12. Эти инфекции часто состоят из различных видов микробов; Однако в последнее время основное внимание уделяется взаимодействию между грамположительной бактерией Staphylococcus aureus и грам-отрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa. Исследования, в том числе пациентов coinfected с этими организмами и в пробирке анализы показывают, как конкурентные и совместные взаимодействия, которые могут иметь глубокое и неожиданное влияние на прогрессирование заболевания, микробное выживание, вирулентность, метаболизм, и антибиотик восприимчивость (подробно рассмотрены Hotterbeekx и др. 2017¹³ и Лимоли и Хоффман 2019³).

Растущий интерес к межвидовому взаимодействию во время инфекции дал различные методы для изучения поведения полимикробного сообщества. Как правило, эти исследования использовали пластины или бульон основе анализов для изучения фенотипических различий между монокультурой и кокультурой. Например, кокулирование P. aeruginosa и S. aureus на твердых поверхностях позволило визуализировать ингибирование роста или изменения в генотипе колонии, пигменте или^{производстве полисахаридов 14,,15,,16.} Смешанные виды биопленок, на биотических или абиотических поверхностях, а также coculturing бактериальных видов в жидкой культуре также позволило измерения изменений в росте, метаболизм, толерантность к антибиотикам, конкуренция и жизнеспособность, в дополнение к генной и белковой^{экспрессии 17,18}. Хотя эти массовые культурные эксперименты показали понимание того, как P. aeruginosa и S. aureus могут влиять друг на друга в масштабах сообщества, они не в состоянии ответить на важные вопросы о взаимодействиях, которые происходят на одноклеточном уровне. Представленный здесь метод дополняет подходы к изучению межвидовых взаимодействий, сосредоточив внимание на изменениях в движении, жизнеспособности клеток и экспрессии генов отдельных клеток в кокультурном сообществе с течением времени.

Одноклеточные взаимодействия могут сильно отличаться от взаимодействий, которые происходят в сообществе ячеек. С помощью одноклеточного анализа неоднородность в сообществе может быть количественно оценена для изучения того, как пространственное размещение клеток влияет на динамику сообщества или как уровни экспрессии генов и белков меняются в отдельных членах группы. Отслеживание ячеек может также дать представление о том, как одиночные клетки перемещаются и ведут себя с течением времени, через несколько поколений. Отслеживая движение клеток и изменения в экспрессии генов одновременно, можно сделать корреляцию между колебаниями генов и соответствующими фенотипами. Описаны предыдущие протоколы изучения отдельных видов бактерий на одноклеточном уровне. Эти исследования используют живые клетки изображения с течением времени в одной плоскости, и были полезны для наблюдения фенотипов, как деление^{клеток и чувствительность к антибиотикам 19,20}. Дополнительная живая микроскопия была использована для мониторинга роста, подвижности, колонизации поверхности и формирования биопленки отдельных бактериальных^{видов 21,,22,,23}. Однако, в то время как эти исследования были проницательными для понимания физиологии бактерий в монокультуре, эксперименты по наблюдению одноклеточного поведения нескольких бактериальных видов с течением времени в кокультуре ограничены.

Здесь предыдущие протоколы, используемые для одно вида изображения были адаптированы для изучения взаимодействий между P. aeruginosa и S. aureus. Эти организмы могут быть дифференцированы в фазовом контрасте на основе их морфологии клеток(P. aeruginosa являются бациллы и S. aureus являются cocci). Разработка этого метода недавно позволила визуализировать ранее неописанные подвижности поведения P. aeruginosa в присутствии S. aureus²⁴. Было установлено, что P. aeruginosa способен чувствовать S. aureus на расстоянии и реагировать с увеличением и направленной одноклеточных движений к скоплениям S. aureus клеток. P. aeruginosa движение в сторону S. aureus было установлено, требуют типа IV pili (TFP), волосы, как прогнозы, чьи скоординированные расширение и опровержение генерировать движение называется подергивания^{подвижность 25}.

Эти исследования демонстрируют полезность этого метода для допроса более ранних взаимодействий между видами. Тем не менее, визуализация при высокой плотности клеток в более поздних точках времени взаимодействия затруднена, учитывая, что одиночные слои клеток больше не могут быть идентифицированы, что в основном создает проблемы во время пост-изображения анализа. Учитывая это ограничение, метод лучше всего подходит для более ранних взаимодействий, которые затем могут сопровождаться традиционными макроскопическими анализами при более высокой плотности клеток, репрезентативными для более поздних взаимодействий. Дополнительные ограничения этого метода включают в себя низкую пропускную способность природы, так как только один образец может быть изображен в то время, и стоимость микроскопа, камеры и экологической камеры. Кроме того, флуоресцентная микроскопия создает риски для бактериальных клеток, таких как фототоксичность и фотопотливость, что ограничивает частоту флуоресценции изображения могут быть приобретены. Наконец, агарозные прокладки, используемые в этом методе, очень восприимчивы к изменениям в окружающей среде, что делает его критическим для контроля условий, таких как температура и влажность, учитывая, что колодки могут начать сокращаться или расширяться, если условия не являются правильными. Наконец, хотя этот метод не имитирует окружающую среду хозяина, он дает подсказки о том, как различные бактериальные виды реагируют на поверхностях, которые могут быть продолжены в анализах, предназначенных для имитации условий окружающей среды/хозяина.

Этот метод отличается от предыдущих исследований отслеживания одноклеточного движения, в том, что клетки прививаются между крышкой и агарозой площадку, ограничивая клетки на поверхность. Это позволяет отслеживать ячейки с течением времени в одной плоскости; однако, ограничивает циклы временного поверхностного взаимодействия наблюдается, когда клетки погружены в жидкость²⁶. Дополнительным преимуществом изображений бактерий под агарозной площадкой является то, что она имитирует макроскопические пластины на основе подповерхно-поверхностных анализов прививки классически используется для изучения P. aeruginosa подергивания^{подвижность 25}. В этом анализе, бактериальные клетки прививаются между дном чашки Петри и агара, сохраняя клетки в одной плоскости, как они перемещаются по нижней части блюда наружу от точки прививки, так же, как этот протокол микроскопии.

Протокол замедленной микроскопии для визуализации межвидового взаимодействия, представленный здесь, состоит из 1) подготовки бактериального образца и агарозной площадки, 2) выбора параметров микроскопа для получения изображений и 3) поствизионного анализа. Детальная визуализация движения клеток и отслеживания может быть выполнена путем получения изображений с короткими временными интервалами путем фазового контраста. Микроскопия флуоресценции также может быть использована для определения жизнеспособности клеток или экспрессии генов с течением времени. Здесь мы покажем один пример адаптации к микроскопии флуоресценции за счет добавления красителей жизнеспособности к прокладкам агарозы.