Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

Les communautés polymicrobiales sont communes dans la nature, couvrant une variété de^{l’environnement 1,,2,3} et les niches humaines^4,5. Certaines des infections polymicrobiales les plus notoires dans la maladie humaine incluent les biofilms dentaires⁶, les blessures chroniques^7,8, et les infections respiratoires chez les personnes atteintes de la maladie pulmonaire obstructive chronique⁹, pneumonie contamile associée à ventilateur¹⁰, et la mucoviscidose de la maladie génétique (CF)^11,12. Ces infections sont souvent composées de diverses espèces microbiennes; cependant, un accent récent sur les interactions entre la bactérie Gram-positive Staphylococcus aureus et la bactérie gram-négative Pseudomonas aeruginosa a émergé. Des études comprenant des patients atteints de ces organismes et des analyses in vitro révèlent des interactions compétitives et coopératives qui peuvent avoir des influences profondes et inattendues sur la progression de la maladie, la survie microbienne, la virulence, le métabolisme et la susceptibilité aux antibiotiques (revues en détail par Hotterbeekx et al.^{2017 13} et Limoli et Hoffman 2019³).

L’intérêt croissant pour les interactions inter-espèces pendant l’infection a donné lieu à une variété de méthodes pour étudier les comportements communautaires polymicrobaires. Typiquement, ces études ont utilisé des essais à base de plaque ou de bouillon pour étudier les différences phénotypiques entre la monoculture et la coculture. Par exemple, la coculture P. aeruginosa et S. aureus sur les surfaces solides a permis la visualisation de l’inhibition de la croissance ou des changements dans la production de phénotype, de pigment ou de polysaccharide de colonie^14,15,16. Les biofilms d’espèces mixtes, sur des surfaces biotiques ou abiotiques, ainsi que la coculture d’espèces bactériennes en culture liquide ont également permis de mesurer les changements dans la croissance, le métabolisme, la tolérance aux antibiotiques, la concurrence et la viabilité, en plus de l’expression des gènes et des protéines^17,18. Bien que ces expériences culturelles en vrac aient révélé comment P. aeruginosa et S. aureus pourraient s’influencer mutuellement à l’échelle communautaire, ils sont incapables de répondre à des questions importantes sur les interactions qui ont lieu au niveau unicellulaire. La méthode présentée ici ajoute aux approches pour l’étude des interactions inter-espèces en se concentrant sur les changements dans le mouvement, la viabilité cellulaire, et l’expression des gènes des cellules uniques au sein d’une communauté coculturée au fil du temps.

Les interactions unicellulaires peuvent différer considérablement des interactions qui ont lieu dans une communauté de cellules en vrac. Grâce à l’analyse unicellulaire, l’hétérogénéité au sein d’une communauté peut être quantifiée pour étudier comment le placement spatial des cellules influence la dynamique de la communauté ou comment les niveaux d’expression des gènes et des protéines changent au sein des membres individuels d’un groupe. Les cellules de suivi peuvent également fournir un aperçu de la façon dont les cellules uniques se déplacent et se comportent au fil du temps, à travers plusieurs générations. En suivant simultanément le mouvement cellulaire et les changements dans l’expression des gènes, des corrélations peuvent être faites entre les fluctuations des gènes et les phénotypes correspondants. Des protocoles antérieurs pour l’étude des espèces bactériennes individuelles au niveau unicellulaire ont été décrits. Ces études tirent parti des cellules d’imagerie vivante au fil du temps dans un seul plan, et ont été utiles pour observer des phénotypes comme la division cellulaire et la susceptibilité aux antibiotiques^19,20. D’autres microscopies d’imagerie vivante ont été utilisées pour surveiller la croissance, la motilité, la colonisation de surface et la formation de biofilms d’espèces bactériennes simples^21,22,23. Cependant, bien que ces études aient été perspicaces pour comprendre la physiologie des bactéries en monoculture, les expériences pour observer le comportement unicellulaire de plusieurs espèces bactériennes au fil du temps dans la coculture sont limitées.

Ici, les protocoles antérieurs utilisés pour l’imagerie par une seule espèce ont été adaptés pour étudier les interactions entre P. aeruginosa et S. aureus. Ces organismes peuvent être différenciés en contraste de phase en fonction de leurs morphologies cellulaires(P. aeruginosa sont bacillis et S. aureus sont cocci). Le développement de cette méthode a récemment permis la visualisation de comportements de motilité précédemment non décrits de P. aeruginosa en présence de S. aureus²⁴. P. aeruginosa s’est avéré capable de détecter S. aureus à distance et de répondre avec des mouvements monocellulaires accrus et directionnels vers des grappes de cellules de S. aureus. P. aeruginosa mouvement vers S. aureus a été trouvé pour exiger le type IV pili (TFP), projections de cheveux dont l’extension coordonnée et la rétraction générer un mouvement appelé motilité twitching²⁵.

Ces études démontrent l’utilité de cette méthode pour interroger les interactions antérieures entre les espèces. Cependant, l’imagerie à des densités cellulaires élevées à des moments d’interaction ultérieurs est difficile étant donné que les couches uniques de cellules ne peuvent plus être identifiées, ce qui pose principalement des problèmes lors de l’analyse post-imagerie. Compte tenu de cette limitation, la méthode est la mieux adaptée pour les interactions antérieures qui pourraient ensuite être suivies avec des tests macroscopiques traditionnels à des densités cellulaires plus élevées représentatives des interactions ultérieures. Les limites supplémentaires de cette méthode incluent la nature à faible débit, puisqu’un seul échantillon peut être photographié à la fois et le coût du microscope, de la caméra et de la chambre environnementale. En outre, la microscopie de fluorescence pose des risques pour les cellules bactériennes comme la phototoxicité et le photobleaching, limitant ainsi la fréquence à laquelle les images de fluorescence peuvent être acquises. Enfin, les coussinets d’agarose utilisés dans cette méthode sont très sensibles aux changements dans l’environnement, ce qui rend essentiel pour contrôler des conditions comme la température et l’humidité, étant donné que les plaquettes peuvent commencer à rétrécir ou se développer si les conditions ne sont pas correctes. Enfin, bien que cette méthode n’imite pas l’environnement hôte, elle fournit des indices sur la façon dont différentes espèces bactériennes réagissent sur les surfaces, qui peuvent être suivies dans des tests conçus pour imiter les conditions environnementales/hôtes.

Cette méthode diffère des études précédentes de suivi du mouvement unicellulaire, en ce que les cellules sont inoculées entre un couvercle et un tampon agarose, limitant les cellules à la surface. Cela permet le suivi cellulaire au fil du temps dans un seul plan; toutefois, limite les cycles d’engagement transitoire de surface observés lorsque les cellules sont submergées dans le liquide²⁶. Un autre avantage des bactéries d’imagerie sous un tampon d’agarose est qu’il imite les essais d’inoculation sub-surface macroscopiques à base de plaques classiquement utilisés pour examiner P. aeruginosa twitching motilité²⁵. Dans ce test, les cellules bactériennes sont inoculées entre le fond d’une boîte de Pétri et l’agar, en gardant les cellules dans un seul plan comme ils se déplacent à travers le fond du plat vers l’extérieur à partir du point d’inoculation, un peu comme ce protocole de microscopie.

Le protocole de microscopie time-lapse pour visualiser les interactions interspécifères présenté ici se compose de 1) la préparation de l’échantillon bactérien et du tampon d’agarose, 2) la sélection des paramètres de microscope pour l’acquisition d’imagerie et 3) l’analyse post-imagerie. La visualisation détaillée du mouvement et du suivi des cellules peut être effectuée par l’acquisition d’images à de courts intervalles de temps par contraste de phase. La microscopie de fluorescence peut également être utilisée pour déterminer la viabilité cellulaire ou l’expression des gènes au fil du temps. Ici, nous montrons un exemple d’adaptation pour la microscopie de fluorescence par l’ajout de colorants de viabilité aux coussinets d’agarose.