Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi
Summary
Burada sunulan, floresan etiketli antikorları iletmek ve mikroglia’yı aktive etmek için kan-beyin bariyerini (BBB) fokal olarak veya bir fare beyni boyunca geçici olarak açmak için bir protokoldür. Ayrıca histoloji ile antikorların ve mikroglia aktivasyonunun verilmesini tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Beyin hastalıklarını hedef alan terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin tarafından alınır. Fokuslu ultrason, kan-beyin bariyerinin (BBB) geçici olarak açılması yoluyla antikorların alımını ve katılımını arttırma imkanı sunar. Laboratuvarımızda nörodejeneratif hastalıklar için mikrokabarcıklar kullanılarak BBB boyunca çeşitli formatlarda bir antikorun verildiği, kafatası üzerinden birden fazla noktayı hedef alan odaklanmış ultrason uygulamasıyla eş zamanlı olarak terapötik yaklaşımlar geliştiriyoruz, bu yaklaşıma tarama ultrasonu (SUS) diyoruz. Mikrokabarcıkların ve ultrasonun kan damarları üzerindeki mekanik etkileri, sıkı kavşakları geçici olarak ayırarak BBB boyunca parasellüler transportu arttırır ve vezikül aracılı transsitozu arttırır, antikorların ve terapötik ajanların etkili bir şekilde geçmesine izin verir. Dahası, ultrason ayrıca antikorların interstisyel beyinden, antikorun hücre gövdesi boyunca ve hatta nöritik süreçlere dağıldığı nöronlar gibi beyin hücrelerine alımını kolaylaştırır. Çalışmalarımızda floresan etiketli antikorlar hazırlanır, kurum içinde hazırlanan lipit bazlı mikrokabarcıklarla karıştırılır ve beyne SUS uygulanmadan hemen önce farelere enjekte edilir. Beyindeki artan antikor konsantrasyonu daha sonra ölçülür. Normal beyin homeostazındaki değişiklikleri açıklamak için, mikroglial fagositoz hücresel bir belirteç olarak kullanılabilir. Üretilen veriler, antikorların ultrasonla verilmesinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde çekici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.
Introduction
Terapötik ultrason, kısmen terapötik ajanların beyne erişimini kolaylaştırarak, beyin hastalıklarını invaziv olmayan bir şekilde tedavi etmeyi amaçlayan yeni bir teknolojidir1,2,3. Beyin hastalıklarını hedef alan terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin4 tarafından alınıp beyinde tutulduğundan, terapötik ultrason bunların alımını ve hedef katılımını artırma imkanı sunar5,6.
Laboratuvarımızda nörodejeneratif hastalıklar için mikrokabarcıklar kullanılarak kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca çeşitli formatlarda bir antikorun verildiği terapötik yaklaşımlar geliştiriyoruz. Bunu başarmak için ultrason, tarama ultrasonu (SUS)7 olarak adlandırdığımız bir tarama modu kullanılarak kafatası yoluyla beyne birden fazla noktada uygulanır. Ultrason enerjisi, intravenöz olarak enjekte edilen mikro kabarcıklar ve beyin vaskülatürü arasındaki mekanik etkileşim, BBB’nin sıkı kavşaklarını belirli bir sonikasyon hacminde geçici olarak ayırır ve antikorların ve terapötik ajanlar da dahil olmak üzere diğer yüklerin bu bariyeri etkili bir şekilde geçmesine izin verir7,8,9 . Dahası, ultrasonun interstisyel beyinden antikorların nöronlar gibi beyin hücrelerine alımını kolaylaştırdığı gösterilmiştir, burada antikor hücre gövdesi boyunca ve hatta nöritik süreçlere dağılır5,10.
Alzheimer hastalığı, amiloid β ve tau patolojisi11 ile karakterizedir ve patojenik mekanizmaları incelemek ve terapötik stratejileri doğrulamak için bir dizi hayvan modeli mevcuttur. Ultrasonun tüm beyinde sıralı bir şekilde uygulandığı bir SUS yaklaşımı, birkaç tedavi seansı boyunca tekrarlandığında, amiloid β biriktiren amiloid öncü protein (APP) mutant farelerin beyinlerindeki amiloid plak patolojisini azaltabilir ve amiloidi alan mikrogliayı aktive ederek bilişsel işlevlerde iyileşmeye yol açabilir7. Ultrason ve mikrokabarcıklarla BBB açıklığı da pR5, K3 ve rTg4510 tau transgenik farelerde tau patolojisini azaltır5,12,13. Önemli olarak, mikroglia hücre dışı protein birikintilerini giderirken, SUS tarafından indüklenen intranöronal patolojiler için altta yatan klirens mekanizmalarından biri nöronal otofajinin aktivasyonudur12.
Burada, floresan olarak etiketlenmiş antikorların hazırlandığı ve daha sonra kurum içi lipit bazlı mikrokabarcıklarla karıştırıldığı, ardından anestezi uygulanan farelere retroorbital enjeksiyonun yapıldığı deneysel bir süreci özetliyoruz. Retroorbital enjeksiyon, aynı derecede etkili ve tekrar tekrar gerçekleştirilmesi daha kolay olduğunu bulduğumuz kuyruk damarı enjeksiyonuna bir alternatiftir. Bunu hemen beyne SUS uygulayarak takip eder. Terapötik antikor alımını belirlemek için, fareler kurban edilir ve beyindeki artan antikor konsantrasyonu daha sonra ölçülür. Beyin homeostazındaki değişimin bir vekili olarak, mikroglial fagositik aktivite histoloji ve hacimsel 3D rekonstrüksiyon ile belirlenir.
Üretilen veriler, antikorların ultrasonla verilmesinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde potansiyel olarak çekici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Protokol benzer şekilde diğer ilaç adaylarına ve tanımlanmış boyutlarda floresan etiketli dextrans gibi model kargolara da uygulanabilir14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Floresan etiketli antikorlar, tarama modunda uygulanan mikrokabarcıklarla birlikte odaklanmış ultrason kullanılarak beyne iletilebilir. Antikor iletimi, mikroglial morfoloji ve lizozomal genişleme, taramalı ultrason sonrası floresan mikroskobu ile saptanabilir. Mikroglia, Fc-reseptör aracılı bir süreçte antikorların bağlandığı lizozom antikorlarını ve antijenlerini alabilir4.
Bu yöntemi kullanarak tekrarlanabilir BBB açıklığı ve antikor iletimi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Clem Jones AO’nun Mülkünün, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi’nin [GNT1145580, GNT1176326], Metal Vakfı’nın ve Queensland Eyalet Hükümeti’nin (DSITI, Bilim, Bilgi Teknolojisi ve İnovasyon Bakanlığı) desteğini kabul ediyoruz.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
