Levering van antilichamen in de hersenen met behulp van gerichte scanning echografie
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om de bloed-hersenbarrière (BBB) tijdelijk te openen, hetzij focale of door een muizenbrein om fluorescerend gelabelde antilichamen af te leveren en microglia te activeren. Ook gepresenteerd is een methode om de afgifte van antilichamen en microglia-activering door histologie te detecteren.
Abstract
Slechts een klein deel van de therapeutische antilichamen gericht tegen hersenziekten wordt door de hersenen opgenomen. Gerichte echografie biedt een mogelijkheid om de opname van antilichamen en betrokkenheid te verhogen door tijdelijke opening van de bloed-hersenbarrière (BBB). In ons laboratorium ontwikkelen we therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten waarbij een antilichaam in verschillende formaten over de BBB wordt afgeleverd met behulp van microbubbels, gelijktijdig met gerichte echografietoepassing door de schedel gericht op meerdere plekken, een benadering die we scanning ultrasound (SUS) noemen. De mechanische effecten van microbubbels en echografie op bloedvaten verhogen het paracellulaire transport over de BBB door het tijdelijk scheiden van tight junctions en verbeteren vesikel-gemedieerde transcytose, waardoor antilichamen en therapeutische middelen effectief kunnen kruisen. Bovendien vergemakkelijkt echografie ook de opname van antilichamen uit de interstitiële hersenen in hersencellen zoals neuronen waar het antilichaam zich door het cellichaam en zelfs in neuritische processen verspreidt. In onze studies worden fluorescerend gelabelde antilichamen bereid, gemengd met in-house bereide lipide-gebaseerde microbubbels en geïnjecteerd in muizen onmiddellijk voordat SUS op de hersenen wordt aangebracht. De verhoogde antilichaamconcentratie in de hersenen wordt vervolgens gekwantificeerd. Om rekening te houden met veranderingen in de normale homeostase van de hersenen, kan microgliale fagocytose worden gebruikt als een cellulaire marker. De gegenereerde gegevens suggereren dat ultrasone toediening van antilichamen een aantrekkelijke benadering is om neurodegeneratieve ziekten te behandelen.
Introduction
Therapeutische echografie is een opkomende technologie gericht op de behandeling van hersenziekten op een niet-invasieve manier, deels door de toegang van therapeutische middelen tot de hersenen te vergemakkelijken1,2,3. Aangezien slechts een klein deel van de therapeutische antilichamen gericht tegen hersenziekten wordt opgenomen door en vastgehouden in de hersenen4, biedt therapeutische echografie de mogelijkheid om hun opname en doelbetrokkenheid te verhogen5,6.
In ons laboratorium ontwikkelen we therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten waarbij een antilichaam in verschillende formaten wordt afgeleverd over de bloed-hersenbarrière (BBB) met behulp van microbubbels. Om dit te bereiken, wordt echografie via de schedel in de hersenen op meerdere plekken toegepast met behulp van een scanmodus die we scanning ultrasound (SUS) noemen 7. De mechanische interactie tussen de ultrasone energie, de intraveneus geïnjecteerde microbubbels en de vasculatuur van de hersenen scheidt tijdelijk de tight junctions van de BBB in een bepaald ultrasoonapparaat, waardoor antilichamen en andere ladingen, waaronder therapeutische middelen, deze barrière effectief kunnen passeren7,8,9 . Bovendien is aangetoond dat echografie de opname van antilichamen uit de interstitiële hersenen in hersencellen, zoals neuronen, vergemakkelijkt, waar het antilichaam zich door het cellichaam en zelfs in neuritische processen verdeelt5,10.
De ziekte van Alzheimer wordt gekenmerkt door een amyloïde-β en tau-pathologie11, en een groot aantal diermodellen is beschikbaar om pathogene mechanismen te ontleden en therapeutische strategieën te valideren. Een SUS-benadering, waarbij echografie wordt toegepast in een sequentieel patroon over de hele hersenen, wanneer herhaald gedurende verschillende behandelingssessies, kan amyloïde plaquepathologie in de hersenen van amyloïde-β-deponerende amyloïde precursor eiwit (APP) mutante muizen verminderen en microglia activeren die het amyloïde opnemen, wat leidt tot verbetering van de cognitieve functie7. BBB-opening met echografie en microbubbels vermindert ook tau-pathologie in pR5, K3 en rTg4510 tau transgene muizen5,12,13. Belangrijk is dat, terwijl microglia extracellulaire eiwitafzettingen verwijderen, een van de onderliggende klaringsmechanismen voor intraneuronale pathologieën geïnduceerd door SUS de activering van neuronale autofagie12 is.
Hier schetsen we een experimenteel proces, waarbij fluorescerend gelabelde antilichamen worden bereid en vervolgens worden gemengd met in-house lipide-gebaseerde microbubbels, gevolgd door retroorbitale injectie in verdoofde muizen. Retroorbitale injectie is een alternatief voor staartaderinjectie waarvan we hebben vastgesteld dat het even effectief en eenvoudiger is om herhaaldelijk uit te voeren. Dit wordt onmiddellijk gevolgd door het aanbrengen van SUS op de hersenen. Om de therapeutische antilichaamopname te bepalen, worden muizen opgeofferd en wordt de verhoogde antilichaamconcentratie in de hersenen vervolgens gekwantificeerd. Als proxy van de verandering in de homeostase van de hersenen wordt microgliale fagocytische activiteit bepaald door histologie en volumetrische 3D-reconstructie.
De gegenereerde gegevens suggereren dat ultrasone toediening van antilichamen een potentieel aantrekkelijke benadering is om neurodegeneratieve ziekten te behandelen. Het protocol kan op dezelfde manier worden toegepast op andere kandidaat-geneesmiddelen, evenals modelladingen zoals fluorescerend gelabelde dextrans van gedefinieerde afmetingen14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fluorescerend gelabelde antilichamen kunnen aan de hersenen worden geleverd met behulp van gerichte echografie samen met microbubbels die in een scanmodus worden toegepast. Antilichaamafgifte, microgliale morfologie en lysosomale vergroting kunnen worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie na scanning echografie. Microglia kunnen in hun lysosomen antilichamen en antigenen opnemen waaraan de antilichamen zich hebben gebonden in een Fc-receptor-gemedieerd proces4.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de steun van dr. Clem Jones AO, de National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], de Metal Foundation en de staatsregering van Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
