העברת נוגדנים למוח באמצעות אולטרסאונד סריקה ממוקדת
Summary
מוצג כאן פרוטוקול כדי לפתוח באופן חולף את מחסום הדם – מוח (BBB) או במוקד או בכל מוח העכבר כדי לספק נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית ולהפעיל מיקרוגליה. כמו כן מוצגת שיטה לזהות את המסירה של נוגדנים והפעלת מיקרוגליה על ידי היסטולוגיה.
Abstract
רק חלק קטן מהנוגדנים הטיפוליים הממוקדים במחלות מוח נלקחים על ידי המוח. אולטרסאונד ממוקד מציע אפשרות להגביר את ספיגת הנוגדנים ואת המעורבות באמצעות פתיחה חולפת של מחסום הדם – מוח (BBB). במעבדה שלנו, אנו מפתחים גישות טיפוליות למחלות ניווניות שבהן נוגדן בפורמטים שונים מועבר על פני BBB באמצעות microbubbles, במקביל עם יישום אולטרסאונד ממוקד דרך הגולגולת מיקוד כתמים מרובים, גישה שאנו מכנים סריקת אולטרסאונד (SUS). ההשפעות המכניות של microbubbles ואולטרסאונד על כלי הדם מגביר את התחבורה paracellular על פני BBB על ידי הפרדה חולפת צמתים הדוקים ומשפר טרנסציטוזיס בתיווך שלפוחית, ומאפשר נוגדנים וחומרים טיפוליים לחצות ביעילות. יתר על כן, אולטרסאונד גם מקל על ספיגת נוגדנים מהמוח interstitial לתוך תאי המוח כגון נוירונים שבהם הנוגדן מתפשט בכל גוף התא ואפילו לתהליכים neuritic. במחקרים שלנו, נוגדנים המסומנים בפלואורסצנטיות מוכנים, מעורבבים עם מיקרו-בועות על בסיס שומנים פנימיים ומוזרקים לעכברים מיד לפני ש- SUS מוחל על המוח. ריכוז הנוגדנים המוגבר במוח מכמת לאחר מכן. כדי להסביר שינויים בהומיאוסטזיס המוח נורמלי, פאגוציטוזה microglial יכול לשמש סמן הסלולר. הנתונים שנוצרו מראים כי אספקת אולטרסאונד של נוגדנים היא גישה אטרקטיבית לטיפול במחלות ניווניות.
Introduction
אולטרסאונד טיפולי הוא טכנולוגיה מתפתחת שמטרתה לטפל במחלות מוח באופן לא פולשני, בין היתר על ידי הקלת גישה של סוכנים טיפוליים למוח1,2,3. כמו רק חלק קטן של נוגדנים טיפוליים מיקוד מחלות מוח נלקחים על ידי ונשמר במוח4, אולטרסאונד טיפולי מציע את האפשרות להגדיל את ספיגתם ומעורבות היעד 5,6.
במעבדה שלנו, אנו מפתחים גישות טיפוליות למחלות ניווניות שבהן נוגדן בפורמטים שונים מועבר מעבר למחסום הדם – מוח (BBB) באמצעות מיקרו-בועות. כדי להשיג זאת, אולטרסאונד מוחל דרך הגולגולת לתוך המוח בנקודות מרובות באמצעות מצב סריקה שאנו מתייחסים כמו סריקת אולטרסאונד (SUS)7. האינטראקציה המכנית בין אנרגיית האולטרסאונד, המיקרו-בועות המוזרקות תוך ורידי לבין כלי הדם במוח מפרידה באופן חולף בין הצמתים ההדוקים של ה- BBB בנפח sonication נתון, ומאפשרת לנוגדנים ולמטענים אחרים כולל חומרים טיפוליים לחצות ביעילות את המחסום הזה7,8,9 . יתר על כן, אולטרסאונד הוכח כדי להקל על ספיגת נוגדנים מהמוח interstitial לתוך תאי המוח, כגון נוירונים, שבו הנוגדן מתפשט בכל גוף התא ואפילו לתוך תהליכים neuritic5,10.
מחלת אלצהיימר מאופיינת β עמילואיד ופתולוגיה טאו11, ושלל מודלים של בעלי חיים זמינים לנתח מנגנונים פתוגניים ולאמת אסטרטגיות טיפוליות. גישת SUS, שבאמצעותה אולטרסאונד מוחל בתבנית רציפה על פני המוח כולו, כאשר חוזר על עצמו על פני מספר מפגשי טיפול, יכול להפחית פתולוגיה של פלק עמילואיד במוחם של עמילואיד-β-הפקדת עמילואיד מקדים חלבון עמילואיד (APP) עכברים מוטנטיים ולהפעיל microglia אשר תופסים את העמילואיד, המוביל לשיפור בתפקוד הקוגניטיבי7. פתיחת BBB עם אולטרסאונד ו microbubbles גם מפחית פתולוגיה טאו pR5, K3 ו rTg4510 tau עכברים מהונדסים 5,12,13. חשוב לציין, בעוד מיקרוגליה להסיר פיקדונות חלבון חוץ תאיים, אחד ממנגנוני הסיווג הבסיסיים עבור פתולוגיות תוך-ניורוניות הנגרמות על ידי SUS הוא ההפעלה של autophagy עצביים12.
כאן, אנו מתארים תהליך ניסיוני, שבאמצעותו מכינים נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית, ולאחר מכן מעורבבים עם מיקרו-בועות מבוססות שומנים פנימיים, ואחריהן הזרקה רטרואורביטלית לעכברים מורדמים. הזרקה Retroorbital היא חלופה הזרקת וריד הזנב אשר מצאנו להיות יעיל באותה מידה ופשוט יותר לבצע שוב ושוב. זה מיד לאחר מכן על ידי החלת SUS על המוח. כדי לקבוע את ספיגת הנוגדנים הטיפוליים, עכברים מוקרבים וריכוז הנוגדנים המוגבר במוח מכמת לאחר מכן. כבא כוח של השינוי בהומיאוסטזיס במוח, פעילות פאגוציטית מיקרוגליאלית נקבעת על ידי היסטולוגיה ושחזור תלת-ממדי נפחי.
הנתונים שנוצרו מראים כי אספקת אולטרסאונד של נוגדנים היא גישה אטרקטיבית פוטנציאלית לטיפול במחלות ניווניות. הפרוטוקול יכול להיות מיושם באופן דומה על מועמדים אחרים לתרופה, כמו גם מטעני מודל כגון dextrans מסומן פלואורסצנטית של גדלים מוגדרים14.
Protocol
Representative Results
Discussion
נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית יכולים להיות מועברים למוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד יחד עם microbubbles מיושם במצב סריקה. אספקת נוגדנים, מורפולוגיה מיקרוגליאלית והגדלה ליזומלית ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר אולטרסאונד סריקה. מיקרוגליה יכולה לקלוט את נוגדני הליזוזוזומים וה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכת האחוזה של ד”ר קלם ג’ונס AO, המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה [GNT1145580, GNT1176326], קרן המתכת וממשלת מדינת קווינסלנד (DSITI, המחלקה למדע, טכנולוגיית מידע וחדשנות).
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
