JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

Patatesteki endojen mikroRNA’ları (miRNA’lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Abstract

Virüs bazlı mikroRNA susturma (VbMS), bitkilerdeki mikroRNA’ların (miRNA’lar) fonksiyonel karakterizasyonu için hızlı ve verimli bir araçtır. VbMS sistemi Nicotiana benthamiana, domates, Arabidopsis, pamuk ve buğday ve mısır gibi monokot bitkileri de dahil olmak üzere çeşitli bitki türleri için geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Burada, patatesteki endojen miRNA’ları susturmak için PVX tabanlı VbMS vektörlerini kullanarak ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Belirli bir miRNA’nın ifadesini yıkmak için, ilgi çekici miRNA’nın hedef mimik (TM) molekülleri tasarlanmış, bitki virüs vektörlerine entegre edilmiş ve patateste Agrobacterium infiltration ile doğrudan ilgi çekici sonojen miRNA’ya bağlanmak ve işlevini engellemek için ifade edilir.

Introduction

Bitki mikroRNA’ları (miRNA’lar) 20-24 nükleotid uzunluğunda, nükleer kodlu düzenleyici RNA’lar1 olarak karakterize edilir ve büyüme ve gelişme2,3, fotosentez ve metabolizma4,5,6,7, hormon sentezi ve sinyalizasyon8,9, biyotik ve abiyotik yanıtlar dahil olmak üzere bitki biyolojik süreçlerinin hemen hemen her alanında temel roller oynar10, 11,12,13 ve besin ve enerji düzenlemesi14,15. Tesis miRNA’larının düzenleyici rolleri iyi programlanır ve genellikle transkripsiyon sonrası seviyelerde hedef mRNA’ları ayırarak veya çeviriyle bastırarak yerine getirilir.

Patateste miRNA’ların tanımlanması, transkripsiyonal profil oluşturma ve hedef tahminine doğru muazzam ilerleme kaydedildi16,17,18,19,20,21. Bununla birlikte, patates de dahil olmak üzere bitkilerdeki miRNA’ların fonksiyonel karakterizasyonu, verimli ve yüksek verimli genetik yaklaşımların olmaması nedeniyle diğer organizmaların gerisinde kaldı. Standart fonksiyon kaybı analizi ile bireysel miRNA’nın fonksiyonel analizini yapmak zordur, çünkü çoğu miRNA önemli genetik artıklığa sahip ailelere aittir22. Buna ek olarak, tek bir miRNA birden fazla hedef geni kontrol edebilir23 ve birkaç farklı miRNA aynı moleküler yolu işbirliği içinde modüle edebilir24,25. Bu özellikler, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin işlevini karakterize etmeyi zorlaştırır.

MiRNA’ların fonksiyonel analizinin çoğu, belirgin sınırlamaları olan işlev kazancı yaklaşımlarına büyük ölçüde güvenmektedir. Yapay miRNA (amiRNA) yöntemi, miRNA’ları yüksek düzeyde üretmek için endojen primer transkriptlerden (pri-miRNA’ lar) yararlanır ve hedef gen ekspresyonunun inhibisyonunu önler26,27,28,29. Bununla birlikte, güçlü bir constitutive 35S promotörü kullanarak aktivasyon etiketleme ve miRNA aşırı ekspresyonu genellikle in vivo koşulları temsil etmeyen ve bu nedenle miRNAs30’un endojen işlevini yansıtmayabilecek miRNA’ların yüksek ekspresyonuna yol açar. Bağlama ve/veya bölünme bölgelerinde temizlenemez mutasyonlar içeren hedef genlerin miRNA’ya dirençli formlarının ekspresyonini içeren alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir31,32,33. Ancak bu yaklaşım, transgenik eserler nedeniyle miRNA dirençli hedef transgeneden türetilen fenotipin yanlış yorumlanmasına da neden olabilir. Bu nedenle, bu fonksiyon kazanım çalışmalarından sonuçlar dikkatle çıkarılmalıdır34. Yukarıda açıklanan yaklaşımların bir diğer önemli sınırlaması, emek yoğun ve zaman alıcı olan dönüşümü gerektirmeleridir. Ayrıca, transgene bağımlı yaklaşımlar dönüşüm-recalcitrant bitki türleri için neredeyse geçerli değil. Bu nedenle, miRNA’ların işlevini çözmek için hızlı ve verimli bir işlev kaybı yaklaşımı geliştirmek önemlidir.

Dönüştürme prosedürünün ön koşulunı atlamak için, hedef mimik (TM) stratejilerini virüs türevli vektörlerle birleştirerek virüs tabanlı mikroRNA susturma (VbMS) oluşturulmuştur. VbMS sisteminde, yapay olarak tasarlanmış TM molekülleri geçici olarak bir virüs omurgasından ifade edilir ve bitki endojen miRNA’ların işlevini parçalamak için güçlü, yüksek verim ve zaman kazandıran bir araç sunar35,36. VbMS başlangıçta tütün çıngırak virüsü (TRV)35,36,37 ile N. benthamiana ve domates geliştirilmiştir ve Arabidopsis genişletilmiştir, pamuk, buğday ve mısır, patates virüsü X (PVX)38, pamuk yaprağı buruşuk virüs (ClCrV)39, salatalık mozaik virüsü (CMV)40,41,42, Çin buğday mozaik virüsü (CWMV)43 dahil olmak üzere diğer çeşitli virüs ifade sistemlerini kullanarak ve arpa şerit mozaik virüs (BSMV)44,45.

Patates (Solanum tuberosum), yüksek besin değeri, yüksek enerji üretimi ve nispeten düşük girdi gereksinimleri nedeniyle dünyanın en önemli dördüncü gıda ürünü ve en yaygın olarak yetiştirilen noncereal mahsulüdür46. Patatesin çeşitli özellikleri onu çekici bir dikotilendonöz model bitki yapar. Yüksek outcrossing oranı, heterozygozite ve genetik çeşitliliğe sahip bitkisel olarak yayılan bir poliploid mahsulüdür. Bununla birlikte, bugüne kadar, VbMS kullanarak patatesteki miRNA’ların işlevini karakterize eden bir rapor yoktur. Burada, patates bitkilerinde miRNA’ların işlevini değerlendirmek için ligasyondan bağımsız klonlama (LIC) uyarlanmış patates PVX tabanlı VbMS yaklaşımını sunuyoruz38. MiR165/166 ailesini VbMS testini göstermek için seçtik, çünkü miR165/166 ailesi ve hedef mRNA’ları ve Sınıf III homeodomain/Leu fermuarı (HD-ZIP III) transkripsiyon faktörleri 22.47.48 olarak kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. HD-ZIP III genleri meristem gelişimin ve organ polaritesinin temel düzenleyicileridir ve miR165/166 işlevinin bastırılması HD-ZIP III genlerinin ekspresyonunun artmasına neden olarak, apikal hakimiyetin azalması ve yaprak polaritesinin anormal örüntüleri gibi pleotropik gelişimsel kusurlara neden oluyor22,35,38,41 . MiRNA165/166’nın susturuğu ile ilişkili kolayca dekore edilebilir gelişimsel fenotipler, PVX tabanlı VbMS testinin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Bu çalışmada, PVX tabanlı VbMS sisteminin patatesteki miRNA’ların işlevini etkili bir şekilde engelleyebileceğini gösteriyoruz. PVX tabanlı virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) sistemi bir dizi patates çeşidinde kurulduğundan49,50,51,52, bu PVX tabanlı VbMS yaklaşımı büyük olasılıkla çok çeşitli diploid ve tetraploid patates türlerine uygulanabilir.

Protocol

1. Patates Bitkileri Yetiştirin. In vitro patates bitkilerini kültür tüplerinde (25 x 150 mm) Murashige ve Skoog (MS) medyası ve Gamborg vitamini (MS bazal tuz karışımı, Gamborg’un vitamini, 30 g/L sakkaroz, 3,5 g/L agar, pH = 5,7) ile yay. Tüpleri büyüme odasına 20-22 °C, 16 saat ışık/8 saat koyu fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol/m2⭐s1’in altına yerleştirin.NOT: Yeni sürgünler ve kökler normalde bitkilerden 1-2 hafta içinde gelişir. Bitkileri her a…

Representative Results

Şekil 2 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Katahdin) damarlar boyunca yaprak laminanın abaksiyel tarafından yaprak dokularının ektopik büyümesi ile göstermektedir. Trompet şeklinde yaprak oluşumu gibi daha şiddetli fenotipler de gözlenmiştir. Buna karşılık PVX kontrol tesislerinde fenotipik anormallik gözlenmedi. Bu sonuçlar, VbMS sisteminin tetraploid patates bitkilerinde endojen miRNA fonksiyonunu bastırmada etkili olduğunu ve PVX-VbMS sisteminin spesifik miRNA’lar?…

Discussion

STTM tasarımını PVX vektörüne entegre ederek patatesteki endojen miRNA’ların işlevini karakterize etmek için PVX tabanlı bir miRNA susturma sistemi sunuyoruz. VbMS sisteminin, bitki türleri arasında yüksek oranda korunmuş bir miRNA ailesi olan patateste miRNA165/166’nın susturılmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.

TM yaklaşımı, hedeflenen miRNA’nın elenmesi ve etkinliğinin tutuklanmasıyla sonuçlanan miRNA tamamlama sırasında beklenen bölünme bölgesinde uyumsuz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PVX-LIC vektörü sağladığı için Tsinghua Üniversitesi’nden Dr. Yule Liu’ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü’nden JS’ye TEX0-1-9675 Hatch Projesi’nden bir başlangıç fonu tarafından desteklendi.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -. P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -. K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -. J., Lin, S. -. I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -. K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G., Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. . Functional Genomics: Methods and Protocols. , 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -. S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P., Kodama, H., Komamine, A. . RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. , 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E., Kovalchuk, I. . Plant Epigenetics: Methods and Protocols. , 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -. Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs – Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Potato Virus XMicroRNA SilencingVbMSVirus-based MicroRNA SilencingMiRNAFunctional CharacterizationShort Tandem Target MimicPVXLigation Independent Cloning

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image