JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

فيروس البطاطا X القائم على إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق (VbMS) في البطاطا.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

نقدم بروتوكولا مفصلا لنظام إسكات الحمض النووي الريبي المصغر (VbMS) القائم على فيروس البطاطس (PVX) لتوصيف الحمض النووي الريبي الداخلي (miRNAs) وظيفيا في البطاطا. يتم دمج جزيئات محاكاة الهدف (TM) من ميرنا ذات الأهمية في ناقل PVX ويتم التعبير عنها بشكل عابر في البطاطا لإسكات عائلة ميرنا أو ميرنا المستهدفة.

Abstract

إن إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق القائم على الفيروسات (VbMS) هو أداة سريعة وفعالة لتوصيف وظيفي للرنانات الدقيقة (ميرناس) في النباتات. وقد تم تطوير وتطبيق نظام VbMS لمختلف الأنواع النباتية بما في ذلك نيكوتيانا بنثاميانا والطماطم وأرابيدوس والقطن ونباتات المونوكوت مثل القمح والذرة. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل باستخدام ناقلات VbMS المستندة إلى PVX لإسكات ميرناس الذاتية في البطاطا. لهدم التعبير عن ميرنا محددة، يتم تصميم جزيئات محاكاة الهدف (TM) من ميرنا من الفائدة، ودمجها في ناقلات الفيروس النباتي، وأعرب في البطاطا عن طريق تسلل Agrobacterium لربط مباشرة إلى ميرنا الذاتية من الفائدة ومنع وظيفتها.

Introduction

وتتميز الرنانات الدقيقة النباتية (ميرناس) بأنها 20-24 النيوكليوتيدات طويلة، الحمض النووي المشفرة RNAs1 وتلعب أدوارا أساسية في كل جانب تقريبا من العمليات البيولوجية النباتية، بما في ذلك النمو والتنمية2،3، التمثيل الضوئي والتمثيل الغذائي4،5،6،7، توليف الهرمونات و signaling8،9، الاستجابات الحيوية والأحيائية10، 11,12,13، وتنظيم المغذيات والطاقة14,15. الأدوار التنظيمية لل ميرناس النبات مبرمجة بشكل جيد ويتم الوفاء بها عادة على مستويات ما بعد النسخ إما عن طريق شق أو قمع الرنانات المستهدفة.

وقد أحرز تقدم هائل نحو تحديد الهوية، والتنميط النسخي، والتنبؤ المستهدف بال ميرناس في البطاطا16,17,18,19,20,21. غير أن التوصيف الوظيفي لل ميرناس في النباتات، بما في ذلك البطاطا، قد تخلف عن الكائنات الحية الأخرى بسبب عدم وجود نهج جينية فعالة وعالية الإنتاجية. من الصعب إجراء تحليل وظيفي ل miRNA الفردية من خلال تحليل فقدان الوظيفة القياسي ، لأن معظم الحمض النووي الريبي ينتمي إلى عائلات لديها تكرار وراثي كبير22. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل ميرنا واحدة التحكم في الجينات المستهدفة المتعددة23 ويمكن للعديد من ميرناس مختلفة تعديل نفس المسار الجزيئي بشكل تعاوني2425. هذه الخصائص تجعل من الصعب توصيف وظيفة ميرنا محددة أو عائلة ميرنا.

وقد اعتمد الكثير من التحليل الوظيفي لل ميرناس اعتمادا كبيرا على نهج تحقيق مكاسب في الوظائف لها حدود واضحة. وتستغل طريقة ميرنا الاصطناعية (amiRNA) النصوص الأولية الذاتية (pri-miRNAs) لإنتاج الحمض النووي الريبي على مستوى عال، مما يؤدي إلى تثبيط التعبير الجيني المستهدف26,27,28,29. ومع ذلك ، فإن وضع علامات التنشيط والتعبير المفرط عن ميرنا باستخدام مروج قوي مكون ل 35S غالبا ما يؤدي إلى زيادة التعبير عن ميرناس التي لا تمثل في ظروف الجسم الحي وبالتالي قد لا تعكس الوظيفة الذاتية ل miRNAs30. وقد تم تطوير نهج بديل يتضمن التعبير عن أشكال مقاومة للجينات المستهدفة التي تحتوي على طفرات غير قابلة للعمومية في مواقع الربط و / أو الانقسام31,32,33. ولكن هذا النهج يمكن أن يسبب أيضا سوء تفسير النمط الظاهري المستمدة من المتحولين جنسيا الهدف مقاومة ميرنا بسبب التحف المعدلة وراثيا. ولذلك، ينبغي استخلاص استنتاجات من هذه الدراسات المتعلقة بمكاسب الوظائف بحذر34. وثمة قيد رئيسي آخر على النهج المذكورة أعلاه هو أنها تتطلب التحول، وهو يتطلب عمالة كثيفة ويستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإن النهج المعتمدة على التحول لا تكاد تنطبق على الأنواع النباتية المحولة. ولذلك، من الضروري تطوير نهج سريع وفعال لفقدان الوظيفة لكشف وظيفة الميرناس.

لتجاوز الشرط الأساسي لإجراء التحويل، تم إنشاء إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق القائم على الفيروسات (VbMS) من خلال الجمع بين استراتيجيات محاكاة الهدف (TM) مع ناقلات مشتقة من الفيروس. في نظام VbMS ، يتم التعبير عن جزيئات TM المصممة اصطناعيا بشكل عابر من العمود الفقري للفيروس ، مما يوفر أداة قوية وعالية الإنتاجية وتوفير الوقت لتشريح وظيفة miRNAs35،36 النباتية الذاتية. تم تطوير VbMS في البداية في N. بنتاميانا والطماطم مع فيروس حشرجة التبغ (TRV)35,36,37 وتم توسيع نطاقه ليشمل أرابيدوسيس والقطن والقمح والذرة باستخدام مختلف أنظمة التعبير عن الفيروسات الأخرى، بما في ذلك فيروس البطاطس X (PVX)38، فيروس فتات أوراق القطن (ClCrV)39، فيروس فسيفساء الخيار (CMV)40,41,42، فيروس فسيفساء القمح الصيني (CWMV)43 ، والشعير شريطية فيروس الفسيفساء (BSMV)44,45.

البطاطا (سولانوم أنبوبي) هو رابع أهم محصول غذائي والمحاصيل غير الcereal الأكثر زراعة على نطاق واسع في العالم أساسا بسبب قيمته الغذائية العالية، وإنتاج الطاقة العالية، ومتطلبات المدخلات منخفضة نسبيا46. العديد من ميزات البطاطا جعلها جذابة dicotyledonous نموذج النبات. وهو محصول متعدد الأضلاع ينتشر بشكل نباتي مع معدل تجاوز عال ، والهتيريوزيجوستي ، والتنوع الوراثي. ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد أي تقرير يميز وظيفة ميرناس في البطاطا باستخدام VbMS. هنا، نقدم استنساخ مستقل الربط (LIC) تكييفها البطاطا PVX القائم على نهج VbMS لتقييم وظيفة ميرناس في نباتات البطاطا38. اخترنا عائلة miR165/166 لتوضيح المقايسة VbMS لأن عائلة miR165/166 وmRNAs المستهدفة والفئة الثالثة homeodomain / ليو سستة (HD-ZIP III) تم وصف عوامل النسخ على نطاق واسع22,47,48. الجينات HD-ZIP III هي المنظمين الرئيسيين لتطوير meristem والقطبية الجهاز، وقمع وظيفة miR165/166 يؤدي إلى زيادة التعبير عن الجينات HD-ZIP III، مما أدى إلى عيوب النمو الجنبي مثل انخفاض الهيمنة apical وأنماط شاذة من قطبية ورقة22،35،38،41 . الأنماط الظاهرية التنموية القابلة للتشقيم بسهولة المرتبطة بإسكات miRNA165/166 تمكن من التقييم الدقيق لفعالية فحص VbMS القائم على PVX.

في هذه الدراسة، ونحن نثبت أن نظام VbMS المستندة إلى PVX يمكن أن تمنع بشكل فعال وظيفة ميرناس في البطاطا. ونظرا لأن نظام إسكات الجينات الناجم عن الفيروسات الكهروضوئية قد أنشئ في عدد من أصناف البطاطا49,50,51,52، فمن المرجح أن يطبق هذا النهج القائم على ال PVX VbMS على مجموعة واسعة من أنواع البطاطا ثنائية الديبلويد والتترابلويد.

Protocol

1. زراعة نباتات البطاطا. نشر في النباتات البطاطا المختبر في أنابيب زراعة (25 × 150 ملم) مع وسائل الإعلام Murashige وسكوغ (MS) بالإضافة إلى فيتامين جامبورغ (MS خليط الملح القاعدي، فيتامين جامبورغ، 30 غرام / لتر السكروز، 3.5 غرام / لتر أجار، pH = 5.7). ضع الأنابيب في غرفة النمو تحت 20-22 درجة مئوية، و16 ساعة ضو…

Representative Results

الشكل 2 يظهر PVX-STTM165/166 نباتات البطاطا (كاتاهدين) مع النمو خارج الرحم من الأنسجة الورقية من الجانب abaxial من صفح ورقة على طول الأوردة. كما لوحظت أنماط ظاهرة أكثر حدة مثل تشكيل أوراق على شكل بوق. في المقابل، لم يلاحظ أي شذوذ فينوتيبيك في محطات التحكم PVX. وتبين هذه النتائج أن نظام VbMS…

Discussion

نحن نقدم PVX القائم على نظام إسكات ميرنا لتوصيف وظيفة ميرناس الذاتية في البطاطا من خلال دمج تصميم STTM في ناقلات PVX. أثبت نظام VbMS فعاليته في إسكات miRNA165/166 في البطاطا ، وهي عائلة ميرنا محفوظة للغاية عبر أنواع النباتات.

وقد تم تطوير نهج TM للتدخل في التعبير عن ميرناس على أساس محاكاة ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور يول ليو من جامعة تسينغهوا على توفير ناقل PVX-LIC. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء التشغيل من أبحاث تكساس A &amp؛ M AgriLife ومشروع هاتش TEX0-1-9675 من المعهد الوطني للأغذية والزراعة في وزارة الزراعة الأميركية إلى JS.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -. P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -. K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -. J., Lin, S. -. I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -. K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G., Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. . Functional Genomics: Methods and Protocols. , 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -. S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P., Kodama, H., Komamine, A. . RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. , 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E., Kovalchuk, I. . Plant Epigenetics: Methods and Protocols. , 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -. Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs – Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Potato Virus XMicroRNA SilencingVbMSVirus-based MicroRNA SilencingMiRNAFunctional CharacterizationShort Tandem Target MimicPVXLigation Independent Cloning

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image