Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

As microRNAs (miRNAs) são caracterizadas como ^RNAs1 regulatórias codificadas por 20 a 24 anos, codificadas por armas nucleares e desempenham papéis fundamentais em quase todos os aspectos dos processos biológicos das plantas, incluindo crescimento e ^{desenvolvimento2,3}, fotossíntese e metabolismo4,5,6,7, síntese hormonal e sinalização ^8,9, respostas biográficas e abióticas10, 11,12,13, e regulação de nutrientes e ^energia14,15. Os papéis regulatórios das miRNAs vegetais são bem programados e cumpridos tipicamente em níveis pós-transcrição, apertando ou reprimindo translacionadamente os mRNAs alvo.

Foram feitos enormes progressos na identificação, perfil transcricional e previsão de metas de miRNAs em batata16,17,18,19,20,21. No entanto, a caracterização funcional de miRNAs em plantas, incluindo batata, tem ficado para trás de outros organismos devido à falta de abordagens genéticas eficientes e de alto rendimento. É desafiador realizar a análise funcional do miRNA individual por análise padrão de perda de função, pois a maioria dos miRNAs pertencem a famílias com considerável redundância ^genética22. Além disso, um único miRNA pode controlar múltiplos ^genes-alvo23 e vários miRNAs diferentes podem modular a mesma via molecular de forma ^{colaborativa24,25}. Essas propriedades dificultam a caracterização da função de um miRNA específico ou de uma família miRNA.

Grande parte da análise funcional das miRNAs tem se apoiado fortemente em abordagens de ganho de função que têm limitações óbvias. O método artificial miRNA (amiRNA) explora as transcrições primárias endógenas (pri-miRNAs) para produzir miRNAs em alto nível, levando à inibição da expressão genética alvo26,27,28,29. No entanto, a marcação de ativação e a superexpressão do miRNA usando um forte promotor 35S constitutivo muitas vezes levam a uma expressão aumentada de miRNAs que não são representativas de condições in vivo e, portanto, podem não refletir a função endógena do ^miRNAs30. Uma abordagem alternativa foi desenvolvida envolvendo a expressão de formas resistentes ao miRNA de genes-alvo que contêm mutações impuros nos locais de ligação e/ou decote31,32,33. Mas essa abordagem também pode potencialmente causar má interpretação do fenótipo derivado do transgene alvo resistente ao miRNA devido a artefatos transgênicos. Portanto, as conclusões desses estudos de ganho de função devem ser tomadas com ^cautela34. Outra grande limitação das abordagens acima descritas é que elas requerem transformação, que é intensiva em mão-de-obra e demorada. Além disso, as abordagens dependentes de transgene dificilmente são aplicáveis para espécies de plantas recalcitrantes de transformação. Portanto, é essencial desenvolver uma abordagem rápida e eficiente de perda de função para desvendar a função dos miRNAs.

Para contornar o pré-requisito do procedimento de transformação, o silenciamento microRNA baseado em vírus (VbMS) foi estabelecido combinando as estratégias de imitação de alvo (TM) com vetores derivados do vírus. No sistema VbMS, moléculas de TM projetadas artificialmente são expressas transitoriamente a partir de uma espinha dorsal do vírus, oferecendo uma poderosa ferramenta de alta produtividade e economia de tempo para dissecar a função de miRNAs ^35,36 endógenos vegetais. O VbMS foi inicialmente desenvolvido em N. benthamiana e tomate com o vírus do chocalho de tabaco (TRV)^35,36,37 e foi estendido para Arabidopsis, algodão, trigo e milho usando vários outros sistemas de expressão de vírus, incluindo o vírus da batata X (PVX)³⁸, o vírus do crumple da folha de algodão (ClCrV)³⁹, o vírus do mosaico de pepino (CMV)40,41,42, vírus do mosaico de trigo chinês (CWMV)⁴³ , e o vírus do mosaico de listras de cevada (BSMV)^44,45.

A batata (solanum tuberosum) é a quarta cultura alimentar mais importante e a cultura noncereal mais cultivada noncereal no mundo principalmente devido ao seu alto valor nutricional, alta produção de energia e requisitos relativamente baixos ^{de insumos46}. Várias características da batata fazem dele uma planta modelo dicotyledonous atraente. É uma cultura poliploide propagada vegetativamente com alta taxa de cruzamento, heterozigosidade e diversidade genética. No entanto, até o momento, não há nenhum relatório caracterizando a função de miRNAs na batata usando VbMS. Aqui, apresentamos uma clonagem independente de ligadura (LIC) adaptada à batata VbMS baseada em VbMS para avaliar a função de miRNAs em plantas de ^batata38. Selecionamos a família miR165/166 para ilustrar o ensaio VbMS porque a família miR165/166 e seus mRNAs alvo e os fatores de transcrição de homeodomína/leu classe III (HD-ZIP III) foram amplamente caracterizados22,47,48. Os genes HD-ZIP III são os principais reguladores do desenvolvimento de meristem e polaridade de órgãos, e a supressão da função miR165/166 leva ao aumento da expressão dos genes HD-ZIP III, resultando em defeitos de desenvolvimento pleotrópico, como a redução da dominância apical e padrões aberrantes de polaridade de folhas222,35,38,41 . Os fenótipos de desenvolvimento facilmente escoráveis correlacionados com o silenciamento do miRNA165/166 permitem uma avaliação precisa da eficácia do ensaio VbMS baseado em PVX.

Neste estudo, demonstramos que o sistema VbMS baseado em PVX pode efetivamente bloquear a função de miRNAs na batata. Como o sistema de silenciamento genético induzido por vírus (VIGS) baseado em PVX foi estabelecido em várias variedades de batata49,50,51,52, essa abordagem VbMS baseada em PVX pode provavelmente ser aplicada a uma ampla gama de espécies de batata diploide e tetraploide.