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Environment

ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

我々は、ポテトウイルスX(PVX)ベースのマイクロRNAサイレンシング(VbMS)システムの詳細なプロトコルを提示し、ポテト中の内因性マイクロRNA(miRNA)を機能的に特徴付ける。目的のmiRNAの標的模倣(TM)分子はPVXベクターに統合され、一過性にジャガイモで発現して標的miRNAまたはmiRNAファミリーを沈黙させる。

Abstract

ウイルスベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)は、植物におけるマイクロRNA(miRNA)の機能的特性評価のための迅速かつ効率的なツールです。ニコ チアナ・ベンタミアナ、トマト、シロイヌナズナ、綿、小麦やトウモロコシなどのモノコット植物など、さまざまな植物種に対してVbMSシステムが開発・適用されています。ここでは、PVXベースのVbMSベクターを用いて、ジャガイモ中の内在性miRNAを沈黙させる詳細なプロトコルについて述べている。特定のmiRNAの発現をノックダウンするために、目的のmiRNAの標的模倣(TM)分子が設計され、植物ウイルスベクターに統合され、 アグロバクテリウム 浸潤によってジャガイモで発現され、目的の内因性miRNAに直接結合し、その機能を遮断する。

Introduction

植物マイクロRNA(miRNA)は、20-24ヌクレオチド長の核コード化された調節RNA1として特徴付けられており、成長および発達2,3、光合成および代謝4,5,6,7、ホルモン合成およびシグナル8,9、生物および非生物応答10、生物合成および非生物応答を含む植物生物学的プロセスのほぼすべての側面において基本的な役割を果たす11,12,13,および栄養素およびエネルギー規制14,15。植物miRNAの調節的役割は、ターゲットmRNAを切断または翻訳的に抑圧することによって、通常、転写後レベルで十分にプログラムされ、果たされます。

ジャガイモ16,17,18,19,20,21におけるmiRNAの同定、転写プロファイリング、および目標予測に向けて大きな進歩が見られました。しかし、ジャガイモを含む植物のmiRNAの機能的特徴付けは、効率的で高スループットな遺伝的アプローチの欠如のために他の生物に遅れをとっている。ほとんどのmiRNAは、かなりの遺伝的冗長性を持つ家族に属するため、標準的な機能損失分析によって個々のmiRNAの機能解析を行うことは困難です22。さらに、単一のmiRNAは複数の標的遺伝子23を制御することができ、いくつかの異なるmiRNAは、同じ分子経路を共同で24,25に調節することができる。これらの特性は、特定のmiRNAまたはmiRNAファミリーの機能を特徴付けることを困難にします。

miRNAの機能分析の多くは、明らかな制限がある機能の得るアプローチに大きく依存してきました。人工miRNA(amiRNA)法は、内因性一次転写物(pri-miRNA)を利用して高レベルでmiRNAを産生し、標的遺伝子発現26,27,28,29の阻害を招く。しかし、強力な構成的な35Sプロモーターを用いた活性化タグ付けおよびmiRNA過剰発現は、多くの場合、インビボ状態を代表しないmiRNAの発現を高め、したがってmiRNA30の内因性機能を反映しない可能性がある。結合および/または切断部位に不用な突然変異を含む標的遺伝子のmiRNA耐性形態の発現を含む別のアプローチが開発された31,32,33。しかし、このアプローチはまた、トランスジェニックアーチファクトによるmiRNA耐性標的トランスジーンに由来する表現型の誤解釈を引き起こす可能性がある。したがって、これらの機能獲得研究からの結論は注意34で描かれるべきである。上述のアプローチのもう一つの大きな制限は、人件数が多く時間のかかる変換が必要なことです。さらに、遺伝子導入依存的アプローチは、変換-再石灰化植物種にはほとんど適用されません。したがって、miRNAの機能を解明するためには、高速かつ効率的に機能喪失アプローチを開発することが不可欠です。

変換手順の前提条件を回避するために、標的模倣(TM)戦略をウイルス由来ベクターと組み合わせることにより、ウイルスベースのマイクロRNAサイレンシング(VbMS)が確立された。VbMSシステムでは、人工的に設計されたTM分子はウイルス骨格から一過性発現し、強力で高スループットで時間を節約するツールを提供し、植物内因性miRNA35,36の機能を解剖します。VbMS は、タバコガラガラウイルス (TRV)35,36,37 を持つ N. ベンタミアナとトマトで開発され、ジャガイモウイルスX(PVX)38、綿葉のくしゃくしゃウイルス (ClCrV)39、 キュウリモザイクウイルス (CMV)40,41,41,422、および大麦ストライプモザイクウイルス(BSMV)44,45。

ジャガイモ(ソラナム結節)は、4番目に重要な食品作物であり、主にその高い栄養価、高エネルギー生産、および比較的低い入力要件のために、世界で最も広く栽培された非穀物作物である46。ジャガイモのいくつかの特徴は、魅力的な二コチドのモデル植物になります。これは、高い外交率、異種性、および遺伝的多様性を有する栄養学的に伝播された多倍化作物である。しかし、現在までに、VbMS を使用したジャガイモの miRNA の機能を特徴付けるレポートはありません。ここでは、ライゲーション非依存クローニング(LIC)適合ポテトPVXベースVbMSアプローチを用いて、ジャガイモ植物におけるmiRNAの機能を評価する38を提示する。miR165/166ファミリーとそのターゲットmRNAおよびクラスIIIホメオドメイン/ルージッパー(HD-ZIP III)転写因子が22,47,48に大きく特徴付けられているため、VbMSアッセイを説明するためにmiR165/166ファミリーを選択しました。HD-ZIP III遺伝子はメリステムの発達と器官極性の主要な調節因子であり、miR165/166機能の抑制はHD-ZIP III遺伝子の発現の増加をもたらし、その結果、有天性優位性の低下や葉極性の異常なパターンなどの多方性発生欠陥が生じる22,35,38,41.容易に相関性のある発生表現型はmiRNA165/166のサイレンシングと相関し、PVXベースのVbMSアッセイの有効性を正確に評価することを可能にする。

本研究では、PVXベースのVbMSシステムがジャガイモ中のmiRNAの機能を効果的に遮断できることを実証した。PVXベースのウイルス誘導遺伝子サイレンシング(VIGS)システムは、多くのジャガイモ品種49,50,51,52に確立されているため、このPVXベースのVbMSアプローチは、広範囲のジプロイドおよびテトラロイドジャガイモ種に適用される可能性が高い。

Protocol

1.ジャガイモの植物を育てます。 培養管(25 x 150 mm)に、ムラシゲとスクーグ(MS)培地にガンボルグのビタミン(MS基底塩混合物、ガンボルグのビタミン、30 g/Lスクロース、3.5 g/L寒天、pH = 5.7)を加えた培養管内のインビトロポテト植物を伝播します。成長室にチューブを20~22°C、16時間光/8時間暗光周期、光強度120μmol/m2∙s1の下に置きます。注:新しい芽や根は通常、植物?…

Representative Results

図2 は、静脈に沿った葉層の腹軸側から葉組織の異所性成長を有するPVX-STTM165/166ジャガイモ植物(Katahdin)を示す。トランペット状の葉形成のようなより厳しい表現型も観察されている。これに対し、PVX制御プラントでは、フェノミツ異常は認められなかった。これらの結果は、VbMSシステムがテトラピドポテト植物の内因性miRNA機能を抑制するのに有効であり、PVX-VbMSシス?…

Discussion

STTM設計をPVXベクターに組み込むことにより、ジャガイモ中の内因性miRNAの機能を特徴づけるためのPVXベースのmiRNAサイレンシングシステムを紹介する。VbMSシステムは、植物種全体で保存度の高いmiRNAファミリーであるジャガイモ中のmiRNA165/166をサイレンシングするのに有効であることが判明した。

TMアプローチは、miRNA相補配列内の期待される切断部位にミスマッチルー?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PVX-LICベクターを提供してくれた清華大学のユレ・リュウ博士に感謝します。この研究は、テキサスA&MアグリライフリサーチとハッチプロジェクトTEX0-1-9675からUSDA国立食糧農業研究所からJSへのスタートアップファンドによって支援されました。

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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