Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Los microARN de las plantas (miRNAs) se caracterizan por ser ARN reguladores de 20 a 24 nucleótidos de longitud, codificados ^{nuclearmente1} y desempeñan un papel fundamental en casi todos los aspectos de los procesos biológicos de las plantas, incluidos el crecimiento y el ^{desarrollo2,3}, la fotosíntesis y el metabolismo4,5,6,7, la síntesis y señalización ^hormonal8,9, las respuestas bióticas y abióticas10^, 11,12,13, y regulación de nutrientes y ^{energía14,15}. Las funciones reguladoras de los miRNAs de las plantas están bien programadas y se cumplen típicamente a niveles post-transcripcionales mediante la escisión o la represión traslacional de los ARNm objetivo.

Se han logrado enormes avances hacia la identificación, el perfil transcripcional y la predicción de objetivos de miRNAs en papa16,17,18,19,20,21. Sin embargo, la caracterización funcional de los miRNAs en plantas, incluida la papa, se ha quedado atrás de otros organismos debido a la falta de enfoques genéticos eficientes y de alto rendimiento. Es difícil realizar análisis funcionales de miRNA individual mediante análisis estándar de pérdida de función, porque la mayoría de los miRNAs pertenecen a familias con redundancia genética ^{considerable22}. Además, un solo miRNA puede controlar múltiples genes ^diana23 y varios miRNAs diferentes pueden modular la misma vía molecular de forma ^{colaborativa24,25}. Estas propiedades dificultan la caracterización de la función de un miRNA específico o una familia de miRNA.

Gran parte del análisis funcional de los miRNAs se ha basado en gran medida en enfoques de ganancia de función que tienen limitaciones obvias. El método de miRNA artificial (amiRNA) explota las transcripciones primarias endógenas (pri-miRNAs) para producir miRNAs a un alto nivel, lo que lleva a la inhibición de la expresión génica diana26,27,28,29. Sin embargo, el etiquetado de activación y la sobreexpresión de miRNA utilizando un fuerte promotor constitutivo de 35S a menudo conducen a una mayor expresión de miRNAs que no son representativos de condiciones in vivo y, por lo tanto, pueden no reflejar la función endógena de ^miRNAs30. Se ha desarrollado un enfoque alternativo que involucra la expresión de formas resistentes a miRNA de genes diana que contienen mutaciones evitables en los sitios de unión y/o escisión31,32,33. Pero este enfoque también puede causar una mala interpretación del fenotipo derivado del transgén objetivo resistente al miRNA debido a artefactos transgénicos. Por lo tanto, las conclusiones de estos estudios de ganancia de función deben extraerse con ^{precaución34}. Otra limitación importante de los enfoques descritos anteriormente es que requieren transformación, que requiere mucha mano de obra y requiere mucho tiempo. Además, los enfoques dependientes de transgenes son difícilmente aplicables para las especies de plantas transformadas-recalcitrantes. Por lo tanto, es esencial desarrollar un enfoque rápido y eficiente de pérdida de función para desentrañar la función de los miRNAs.

Para eludir el requisito previo del procedimiento de transformación, se ha establecido el silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) mediante la combinación de las estrategias de imitación objetivo (TM) con vectores derivados de virus. En el sistema VbMS, las moléculas tm diseñadas artificialmente se expresan transitoriamente desde una columna vertebral del virus, ofreciendo una herramienta potente, de alto rendimiento y ahorro de tiempo para diseccionar la función de los miRNAs endógenos de las ^plantas35,36. VbMS se desarrolló inicialmente en N. benthamiana y tomate con el virus del sonajero del tabaco (TRV)35,36,37 y se ha extendido a Arabidopsis, algodón, trigo y maíz utilizando varios otros sistemas de expresión de virus, incluido el virus de la papa X (PVX)³⁸, el virus de la arruga de la hoja de algodón (ClCrV)³⁹, el virus del mosaico del pepino (CMV)40,41,42, el virus del mosaico del trigo chino (CWMV)⁴³ , y el virus del mosaico de la raya de cebada (BSMV)^44,45.

La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto cultivo alimentario más importante y el cultivo no aéreo más cultivado en el mundo, principalmente debido a su alto valor nutricional, alta producción de energía y requerimientos de insumos relativamente ^bajos46. Varias características de la papa la convierten en una atractiva planta modelo dicotiledónea. Es un cultivo poliploide propagado vegetativamente con alta tasa de cruce, heterocigosidad y diversidad genética. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún informe que caracterice la función de los miRNAs en papa utilizando VbMS. Aquí, presentamos un enfoque VbMS basado en VbMS basado en PVX de papa adaptado a la clonación independiente de la ligadura (LIC) para evaluar la función de los miRNAs en plantas de ^papa38. Seleccionamos la familia miR165/166 para ilustrar el ensayo VbMS porque la familia miR165/166 y sus ARNm objetivo y los factores de transcripción homeodominio/cremallera Leu clase III (HD-ZIP III) se han caracterizado ampliamente22,47,48. Los genes HD-ZIP III son reguladores clave del desarrollo del meristemo y la polaridad de los órganos, y la supresión de la función miR165/166 conduce a una mayor expresión de los genes HD-ZIP III, lo que resulta en defectos de desarrollo pleotrópicos como la reducción de la dominancia apical y los patrones aberrantes de polaridad de la hoja22,35,38,41 . Los fenotipos de desarrollo fácilmente puntuables correlacionados con el silenciamiento de miRNA165/166 permiten una evaluación precisa de la efectividad del ensayo VbMS basado en PVX.

En este estudio, demostramos que el sistema VbMS basado en PVX puede bloquear efectivamente la función de los miRNAs en la papa. Debido a que el sistema de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) basado en PVX se ha establecido en varias variedades de papa49,50,51,52, este enfoque VbMS basado en PVX probablemente se puede aplicar a una amplia gama de especies de papa diploide y tetraploide.