Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

I microRNA vegetali (miRNA) sono caratterizzati da 20-24 RNA regolatori a base di nucleotidi, codificati ^nucleari1 e svolgono un ruolo fondamentale in quasi tutti gli aspetti dei processi biologici delle piante, tra cui crescita e ^sviluppo2,3, fotosintesi e metabolismo4,5,6,7, sintesi e segnalazione ^ormonale8,9, risposte biotiche e abiotiche10, 11,12,13 e regolazione dei nutrienti e dell’energia14,15. I ruoli regolatori dei miRNA vegetali sono ben programmati e soddisfatti tipicamente a livelli post-trascrizionali mediante scissione o repressione traslazionale degli mRNA bersaglio.

Sono stati compiuti enormi progressi verso l’identificazione, la profilazione trascrizionale e la previsione target dei miRNA nella patata16,17,18,19,20,21. Tuttavia, la caratterizzazione funzionale dei miRNA nelle piante, compresa la patata, è rimasta indietro rispetto ad altri organismi a causa della mancanza di approcci genetici efficienti e ad alto rendimento. È difficile eseguire l’analisi funzionale dei singoli miRNA mediante l’analisi standard della perdita di funzione, perché la maggior parte dei miRNA appartiene a famiglie con notevole ridondanza ^genetica22. Inoltre, un singolo miRNA può controllare più geni ^bersaglio23 e diversi miRNA possono modulare lo stesso percorso molecolare ^{in modo collaborativo24,25}. Queste proprietà rendono difficile caratterizzare la funzione di uno specifico miRNA o di una famiglia di miRNA.

Gran parte dell’analisi funzionale dei miRNA si è basata fortemente su approcci di guadagno di funzione che hanno evidenti limitazioni. Il metodo dei miRNA artificiali (amiRNA) sfrutta i trascritti primari endogeni (pri-miRNA) per produrre miRNA ad alto livello, portando all’inibizione dell’espressione genica bersaglio26,27,28,29. Tuttavia, il tagging di attivazione e la sovraespressione di miRNA utilizzando un forte promotore costitutivo 35S spesso portano ad una maggiore espressione di miRNA che non sono rappresentativi delle condizioni in vivo e quindi potrebbero non riflettere la funzione endogena dei ^miRNA30. È stato sviluppato un approccio alternativo che coinvolge l’espressione di forme di geni bersaglio resistenti ai miRNA che contengono mutazioni uncleavable nei siti di legame e/o scissione31,32,33. Ma questo approccio può anche potenzialmente causare un’interpretazione errata del fenotipo derivato dal transgene bersaglio resistente ai miRNA a causa di artefatti transgenici. Pertanto, le conclusioni di questi studi sul guadagno di funzione devono essere tratte con ^cautela34. Un altro importante limite degli approcci sopra descritti è che richiedono una trasformazione, che richiede molta manodopera e tempo. Inoltre, gli approcci transgenici-dipendenti sono difficilmente applicabili per le specie vegetali trasformatrici-recalcitranti. Pertanto, è essenziale sviluppare un approccio rapido ed efficiente alla perdita di funzione per svelare la funzione dei miRNA.

Per aggirare il prerequisito della procedura di trasformazione, è stato stabilito il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) combinando le strategie mimiche target (TM) con vettori derivati da virus. Nel sistema VbMS, le molecole tm progettate artificialmente sono espresse transitoriamente da una spina dorsale del virus, offrendo uno strumento potente, ad alto rendimento e risparmio di tempo per sezionare la funzione dei miRNA endogeni delle ^piante35,36. VbMS è stato inizialmente sviluppato in N. benthamiana e pomodoro con il virus del sonaglio del tabacco (TRV)35,36,37 ed è stato esteso a Arabidopsis, cotone, grano e mais utilizzando vari altri sistemi di espressione del virus, tra cui il virus della patata X (PVX)³⁸, il virus dell’accartocciamento delle foglie di cotone (ClCrV)³⁹, il virus del mosaico del cetriolo (CMV)40,41,42, il virus cinese del mosaico del grano (CWMV)⁴³ , e il virus del mosaico a strisce d’orzo (BSMV)^44,45.

La patata (Solanum tuberosum) è la quarta coltura alimentare più importante e la coltura non cereale più coltivata al mondo principalmente a causa del suo elevato valore nutrizionale, dell’elevata produzione di energia e del fabbisogno di input relativamente ^basso46. Diverse caratteristiche della patata ne fanno un’attraente pianta modello dicotiledone. È una coltura poliploide propagata vegetativamente con alto tasso di outcrossing, eterozigosi e diversità genetica. Tuttavia, ad oggi, non esiste alcun rapporto che caratterizzi la funzione dei miRNA nella patata utilizzando VbMS. Qui presentiamo un approccio VbMS basato su PVX di patate adattato alla clonazione indipendente dalla legatura (LIC) per valutare la funzione dei miRNA nelle piante di ^patate38. Abbiamo selezionato la famiglia miR165/166 per illustrare il test VbMS perché la famiglia miR165/166 e i loro mRNA target e i fattori di trascrizione hd-ZIP III (omeodomain/Leu zipper) di Classe III sono stati ampiamente caratterizzati22,47,48. I geni HD-ZIP III sono regolatori chiave dello sviluppo del meristema e della polarità degli organi, e la soppressione della funzione miR165/166 porta ad una maggiore espressione dei geni HD-ZIP III, con conseguenti difetti dello sviluppo pleotropico come la ridotta dominanza apicale e modelli aberranti di polarità fogliare22,35,38,41 . I fenotipi dello sviluppo facilmente ottenibili correlati con il silenziamento di miRNA165/166 consentono una valutazione accurata dell’efficacia del test VbMS basato su PVX.

In questo studio, dimostriamo che il sistema VbMS basato su PVX può bloccare efficacemente la funzione dei miRNA nella patata. Poiché il sistema di silenziamento genico indotto da virus basato su PVX (VIGS) è stato stabilito in un certo numero di varietà di ^{patate49,50,51,52}, questo approccio VbMS basato su PVX può essere probabilmente applicato a una vasta gamma di specie di patate diploidi e tetraploidi.