JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

Abstract

השתקת מיקרו-רנ”א מבוססת וירוסים (VbMS) היא כלי מהיר ויעיל לאפיון פונקציונלי של מיקרו-רנ”א (miRNAs) בצמחים. מערכת VbMS פותחה ויישמה עבור מיני צמחים שונים כולל ניקוטיאנה בנתמיאנה, עגבניות, Arabidopsis, כותנה, וצמחי מונוקוט כגון חיטה ותירס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט באמצעות וקטורים VbMS מבוססי PVX כדי להשתיק miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה. כדי להפיל את הביטוי של miRNA ספציפי, מולקולות חיקוי יעד (TM) של miRNA של עניין מתוכננים, משולבים בווקטורים וירוס הצמח, ובא לידי ביטוי תפוח אדמה על ידי חדירת אגרובקטריום להיקשר ישירות miRNA אנדוגני של עניין ולחסום את הפונקציה שלה.

Introduction

מיקרו-רנ”א צמחיים (miRNAs) מאופיינים כ-RNAs רגולטוריים באורך 20-24 נוקלאוטידים, המקודדים לגרעין1 וממלאים תפקידים בסיסיים כמעט בכל היבט של תהליכים ביולוגיים צמחיים, כולל צמיחה ופיתוח2,3, פוטוסינתזה וחילוף חומרים4,5,6,7, סינתזת הורמונים ותגובות איתות8,9, ביוטיות ואביוטיות10, 11,12,13, ורגולציה תזונתית ואנרגיה14,15. התפקידים הרגולטוריים של miRNAs צמח מתוכנתים היטב וממולמים בדרך כלל ברמות שלאחר שעתוק על ידי בקעה או דיכוי תרגום של mRNAs היעד.

חלה התקדמות עצומה לקראת זיהוי, פרופיל תמלול וחיזוי יעד של miRNAs בתפוחי אדמה 16,17,18,19,20,21. עם זאת, האפיון התפקודי של miRNAs בצמחים, כולל תפוחי אדמה, מפגר אחרי אורגניזמים אחרים בשל היעדר גישות גנטיות יעילות ובעלות תפוקה גבוהה. זה מאתגר לבצע ניתוח פונקציונלי של miRNA בודדים על ידי ניתוח סטנדרטי של אובדן תפקוד, כי רוב miRNAs שייכים למשפחות עם יתירות גנטית ניכרת22. בנוסף, miRNA יחיד יכול לשלוט גנים יעד מרובים23 וכמה miRNAs שונים יכול לווסת את אותו מסלול מולקולרי בשיתוף פעולה24,25. מאפיינים אלה מקשים על אפיון הפונקציה של miRNA ספציפי או משפחת miRNA.

חלק גדול מהניתוח התפקודי של miRNAs הסתמך במידה רבה על גישות של רווח-של-פונקציה שיש להם מגבלות ברורות. שיטת ה-miRNA המלאכותית (amiRNA) מנצלת את התמלילים העיקריים האנדוגניים (pri-miRNAs) כדי לייצר miRNAs ברמה גבוהה, מה שמוביל לעיכוב ביטוי גן היעד26,27,28,29. עם זאת, תיוג הפעלה וביטוי יתר של miRNA באמצעות מקדם 35S מרכיב חזק מובילים לעתים קרובות לביטוי מוגבר של miRNAs שאינם מייצגים תנאי vivo ולכן לא יכול לשקף את הפונקציה אנדוגני של miRNAs30. פותחה גישה חלופית הכוללת ביטוי של צורות עמידות בפני miRNA של גנים המשמשים כמטרה המכילים מוטציות טמאות באתרי הכריכה ו/או המחשוף31,32,33. אבל גישה זו יכולה גם לגרום לפרשנות שגויה של הפנוטיפ הנגזר מהטרנסג’ן היעד העמיד בפני miRNA עקב חפצים מהונדסים. לכן, מסקנות אלה מחקרים של רווח של פונקציה צריך להסיק בזהירות34. מגבלה מרכזית נוספת של הגישות המתוארות לעיל היא שהן דורשות טרנספורמציה, שהיא עבודה עתירת עבודה וגוזלת זמן רב. יתר על כן, הגישות התלויות בטרנסג’ן אינן ישימות כמעט ללא שינוי עבור מיני צמחים סרבנים. לכן, חיוני לפתח גישה מהירה ויעילה של אובדן תפקוד כדי לפענח את הפונקציה של miRNAs.

כדי לעקוף את תנאי מוקדם של הליך הטרנספורמציה, השתקת מיקרורנ”א מבוססת וירוסים (VbMS) הוקמה על ידי שילוב אסטרטגיות חיקוי היעד (TM) עם וקטורים שמקורם בווירוסים. במערכת VbMS, מולקולות TM שתוכננו באופן מלאכותי מתבטאות באופן חולף מעמוד השדרה של וירוסים, ומציעות כלי רב עוצמה, בעל תפוקה גבוהה וחוסך זמן כדי לנתח את הפונקציה של miRNAs35,36 אנדוגני צמחי. VbMS פותחה בתחילה ב– N. benthamiana ועגבניות עם נגיף רעשן הטבק (TRV)35,36,37 והורחבה לערבידופסיס, כותנה, חיטה ותירס באמצעות מערכות שונות אחרות לביטוי וירוסים, כולל וירוס תפוחי האדמה X (PVX)38, וירוס קמט עלה כותנה (ClCrV)39, וירוס פסיפס מלפפונים (CMV)40,41,42, וירוס פסיפס חיטה סיני (CWMV)43 ווירוס פסיפס פסים שעורה (BSMV)44,45.,

תפוח אדמה (Solanum tuberosum) הוא יבול המזון הרביעי בחשיבותו והיבול הנפוץ ביותר בעולם בעיקר בגלל ערכו התזונתי הגבוה, ייצור אנרגיה גבוהה ודרישות קלט נמוכות יחסית46. מספר תכונות של תפוחי אדמה להפוך אותו צמח מודל dicotyledonous אטרקטיבי. זהו יבול פוליפלואידי שהופצה על ידי צמחייה עם קצב שפיכות גבוה, הטרוזיגוסיות ומגוון גנטי. עם זאת, עד כה, אין דו”ח המאפיין את הפונקציה של miRNAs בתפוח אדמה באמצעות VbMS. כאן, אנו מציגים גישה של שיבוט עצמאי לקשירה (LIC) מבוסס PVX מבוסס VbMS כדי להעריך את הפונקציה של miRNAs בצמחי תפוחי אדמה38. בחרנו את משפחת miR165/166 כדי להמחיש את בדיקת VbMS מכיוון שמשפחת miR165/166 וגורמי התמלול של mRNAs היעד שלהם ורוכסן הביתי השלישי (HD-ZIP III) אופיינו בהרחבה22,47,48. הגנים HD-ZIP III הם רגולטורים מרכזיים של התפתחות מריסטם וקוטביות איברים, ודיכוי של תפקוד miR165/166 מוביל לביטוי מוגבר של הגנים HD-ZIP III, וכתוצאה מכך פגמים התפתחותיים pleotropic כגון דומיננטיות אפית מופחתת ודפוסים חריגים של קוטביות עלים22,35,38,41 . הפנוטיפים ההתפתחותיים הניתנים לציון בקלות בקורלציה עם השתקה של miRNA165/166 מאפשרים הערכה מדויקת של האפקטיביות של בדיקות VbMS מבוססות PVX.

במחקר זה, אנו מדגימים כי מערכת VbMS מבוססת PVX יכולה לחסום ביעילות את הפונקציה של miRNAs בתפוחי אדמה. מכיוון שמערכת השתקת הגנים (VIGS) המבוססת על וירוסים מבוססת PVX הוקמה במספר זני תפוחי אדמה49,50,51,52, גישה זו המבוססת על VbMS מבוססת PVX יכולה להיות מיושמת ככל הנראה על מגוון רחב של מיני תפוחי אדמה דיפלואידים וטטרפלואידים.

Protocol

1. לגדל צמחי תפוחי אדמה. להפיץ צמחים תפוחי אדמה במבחנה בצינורות תרבות (25 x 150 מ”מ) עם Murashige ו Skoog (MS) מדיה בתוספת ויטמין של גמבורג (תערובת מלח בזאלי MS, ויטמין של גמבורג, 30 גרם / L סוכרוז, 3.5 גרם / ליטר אגר, pH = 5.7). מניחים את הצינורות בחדר הצמיחה מתחת ל-20-22 °C (50 °F), 16 שעות אור/8 שעות פוטופריוד כהה, ועוצ?…

Representative Results

איור 2 מציג את צמחי תפוחי האדמה PVX-STTM165/166 (קטהדין) עם צמיחה חוץ רחמית של רקמות עלים מהצד האבקסיאלי של למינה עלים לאורך הוורידים. פנוטיפים חמורים יותר כגון היווצרות עלה בצורת חצוצרה נצפו גם. לעומת זאת, לא נצפתה חריגה פנוטיפית במפעלי הבקרה של PVX. תוצאות אלה מראות כי מערכת VbMS היית…

Discussion

אנו מציגים מערכת השתקה miRNA מבוססת PVX כדי לאפיין את הפונקציה של miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה על ידי שילוב עיצוב STTM לתוך וקטור PVX. מערכת VbMS הוכיחה את עצמה כיעילה בהשתקת miRNA165/166 בתפוחי אדמה, משפחת מירנ”א שמורה ביותר על פני מיני צמחים.

גישת TM פותחה כדי להפריע לביטוי של miRNAs המבוסס על חיקוי …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד”ר יול ליו מאוניברסיטת צינגחואה על שסיפק את וקטור PVX-LIC. עבודה זו נתמכה על ידי קרן סטארט-אפ מטקסס A&M AgriLife Research ופרויקט האץ’ TEX0-1-9675 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי ל- JS.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -. P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -. K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -. J., Lin, S. -. I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -. K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G., Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. . Functional Genomics: Methods and Protocols. , 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -. S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P., Kodama, H., Komamine, A. . RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. , 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E., Kovalchuk, I. . Plant Epigenetics: Methods and Protocols. , 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -. Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs – Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Potato Virus XMicroRNA SilencingVbMSVirus-based MicroRNA SilencingMiRNAFunctional CharacterizationShort Tandem Target MimicPVXLigation Independent Cloning

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image