Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.
La espectrometría de masas de intercambio de deuterio de hidrógeno (HDX-MS) es un potente método para la caracterización biofísica de los cambios de conformación enzimática y las interacciones enzima-sustrato. Entre sus muchos beneficios, HDX-MS consume sólo pequeñas cantidades de material, se puede realizar en condiciones casi nativas sin necesidad de etiquetado enzimático/sustrato, y puede proporcionar información resuelta espacialmente sobre dinámicas de conformación enzimática, incluso para enzimas grandes y complejos multiproteína. El método se inicia mediante la dilución de la enzima de interés en tampón preparado en D2O. Esto desencadena el intercambio de protium en cruces de bonos péptidos (N-H) con deuterio (N-D). En los puntos de tiempo de intercambio deseados, las alícuotas de reacción se enfadan, la enzima se proteica en péptidos, los péptidos están separados por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y el cambio en la masa de cada péptido (debido al intercambio de hidrógeno por deuterio) es registrado por LA. La cantidad de captación de deuterio por cada péptido depende en gran medida del entorno local de unión al hidrógeno de ese péptido. Péptidos presentes en regiones muy dinámicas del deuterio de intercambio de enzimas muy rápidamente, mientras que péptidos derivados de regiones bien ordenadas se intercambian mucho más lentamente. De esta manera, la tasa HDX informa sobre la dinámica de conformación de enzimas locales. Las perturbaciones a los niveles de captación de deuterio en presencia de diferentes ligandos se pueden utilizar para mapear sitios de unión de ligando, identificar redes alotéricas y comprender el papel de la dinámica de conformación en la función enzimática. Aquí, ilustramos cómo hemos utilizado HDX-MS para entender mejor la biosíntesis de un tipo de productos naturales péptidos llamados lanthipeptides. Los lanthipeptides son péptidos genéticamente codificados que son modificados post-traslacionalmente por enzimas grandes, multifuncionales y dinámicas conformadamente que son difíciles de estudiar con enfoques tradicionales de biología estructural. HDX-MS proporciona una plataforma ideal y adaptable para investigar las propiedades mecanicistas de este tipo de enzimas.
Las proteínas son moléculas estructuralmente dinámicas que muestras de diferentes conformaciones en escalas de tiempo que van desde la vibración de unión a escala femtosecond hasta reordenamientos de dominios proteicos enteros que pueden ocurrir durante muchos segundos1. Estas fluctuaciones de conformación suelen ser aspectos críticos de la función enzimática/proteica. Por ejemplo, los cambios de conformación inducidos por la unión de ligando suelen ser de vital importancia para modular la función enzimática, ya sea organizando los residuos activos del sitio necesarios para la catálisis, definiendo sitios de unión de sustratos en mecanismos cinéticos secuenciales, protegiendo los intermediarios reactivos del medio ambiente o modulando la función enzimática a través de redes alotéricas. Estudios recientes también han demostrado que la dinámica de conformación se puede conservar a lo largo de la evolución y que las perturbaciones a los movimientos moleculares conservados pueden correlacionar con cambios en la especificidad del sustrato y la aparición de nuevas funciones enzimáticas2,3.
En los últimos años, la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) ha surgido rápidamente como una poderosa técnica para sondear cómo los paisajes de conformación de proteínas responden a perturbaciones como la unión de ligando o la mutagénesis4,5,6,7. En un experimento típico de HDX-MS(Figura 1),una proteína de interés se coloca en amortiguador preparado en D2O, lo que desencadena la sustitución de protones intercambiables con disolventes con deuteria. El tipo de cambio de la mitad de la mitad de los bonos de péptido depende fuertemente del pH, la secuencia local de aminoácidos, y del entorno estructural local de la mitad8. Las amides que se dedican a interacciones de unión al hidrógeno (como las presentes en α-helices y β hojas) intercambian más lentamente que en medio de regiones no estructuradas de la proteína que están expuestas a disolvente a granel. Por lo tanto, el alcance de la captación de deuterio es un reflejo de la estructura de la enzima. Se espera que las enzimas que son dinámicas de forma conformación, o que se someten a transiciones estructurales en la unión a los ligandos, produzcan una respuesta HDX medible.
La base mecanicista para el tipo de cambio lento de un medio estructurado se muestra en la Figura 25,8,9. Para someterse a HDX, la región estructurada primero debe muestrear transitoriamente una conformación desplegada, de manera que las moléculas solventes que catalizan el intercambio HDX a través de un mecanismo químico específico ácido/base, tengan acceso a la entresuela intercambiable. En última instancia, las magnitudes relativas del tipo de cambio químico (kchem) y las tasas de plegado y reencarnamiento (kopen y kclose) determinan la tasa HDX medida en el experimento5,8. A partir de este sencillo modelo cinético, está claro que el alcance de la captación de deuterio reflejará la dinámica de conformación subyacente (definida por kopen y kclose). La mayoría de los experimentos HDX-MS se realizan en un flujo de trabajo ascendente donde, tras la reacción de intercambio, la proteína de interés se digiere en péptidos y la captación de deuterio por cada péptido se mide como un aumento de la masa7. De esta manera, HDX-MS permite mapear perturbaciones a la dinámica de conformación enzimática en la escala espacial local de péptidos, lo que permite al investigador evaluar cómo la perturbación altera la dinámica en diferentes regiones de la enzima de interés.
Las ventajas del enfoque HDX-MS para dilucidar la dinámica estructural de las proteínas son numerosas. En primer lugar, el método se puede realizar con pequeñas cantidades de proteína nativa o en complejos proteicos en sistemas con estructura cuaternaria10. Ni siquiera es necesario que la preparación enzimática utilizada en el ensayo sea altamente purificada11,12, siempre y cuando el flujo de trabajo hdx-MS de abajo hacia arriba proporcione un número suficiente de péptidos identificados con confianza que cubren la secuencia de proteínas de interés. Además, HDX-MS puede proporcionar información sobre la dinámica de conformación en condiciones casi nativas sin la necesidad de etiquetado proteico específico del sitio, como se utilizaría en los estudios de fluorescencia de molécula única13,y no hay límite de tamaño para el complejo proteico o proteico que se puede investigar (lo que hace que enfoques como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear [NMR] sean desafiantes)7,14. Por último, se pueden emplear métodos HDX-MS resueltos en el tiempo para estudiar proteínas intrínsecamente desordenadas, que son difíciles de estudiar con cristalografía de rayos X15,16,17,18. La principal limitación de HDX-MS es que los datos son de baja resolución estructural. Los datos HDX-MS son útiles para señalar dónde están cambiando las dinámicas de conformación y para revelar cambios de conformación acoplados, pero a menudo no proporcionan mucha información sobre el mecanismo molecular preciso que impulsa el cambio observado. Los recientes avances en la combinación de métodos de disociación de captura de electrones con datos de proteínas HDX-MS han demostrado ser prometedores para mapear sitios de intercambio a residuos de aminoácidos individuales19,pero a menudo se necesitan estudios bioquímicos y estructurales de seguimiento para proporcionar claridad a los modelos estructurales reenviados por datos de HDX-MS.
A continuación, se presenta un protocolo detallado para el desarrollo de un ensayo HDX-MS20. Los protocolos de preparación de muestras que se presentan a continuación deben aplicarse generalmente a cualquier proteína que muestre una buena solubilidad en tampones acuosos. Los métodos de preparación de muestras más especializados y los flujos de trabajo HDX-MS están disponibles para proteínas que necesitan ser ensayos en presencia de detergente o fosfolípidos21,22,23,24. Los ajustes instrumentales para la recopilación de datos HDX-MS se describen para un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo de cuadrúpeda de alta resolución acoplado al sistema de cromatografía líquida. Los datos de complejidad y resolución similares podrían recopilarse en cualquiera de una serie de sistemas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) disponibles comercialmente. También se proporcionan aspectos clave del procesamiento de datos mediante un paquete de software disponible comercialmente. También presentamos directrices para la recopilación y el análisis de datos que sean coherentes con las recomendaciones formuladas por la comunidad más amplia de HDX-MS12. El protocolo descrito se utiliza para estudiar las propiedades estructurales dinámicas de HalM2, una sintátida de lanthipéptido que cataliza la maduración multipaso de un producto natural de péptido antimicrobiano20. Ilustramos cómo HDX-MS se puede utilizar para revelar sitios de enlace de sustratos y propiedades alotéricas que han eludido la caracterización anterior. Varios otros protocolos sobre proteína HDX-MS se han publicado en los últimos años25,26. Junto con el trabajo actual, estas contribuciones anteriores deberían proporcionar al lector cierta flexibilidad en el diseño experimental.
El flujo de trabajo HDX-MS presentado en este protocolo proporciona una plataforma notablemente robusta para mapear la distribución espacial de elementos estructuralmente dinámicos en proteínas y para investigar cómo estas dinámicas cambian en respuesta a la perturbación (unión de ligando, mutagénesis enzimática, etc.). HDX-MS tiene varias ventajas distintas sobre otros enfoques de biología estructural que se utilizan comúnmente para investigar la dinámica de conformación. En particular, sólo se necesitan p…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá, los Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, la Fundación Canadiense para la Innovación y los fondos de puesta en marcha de la Universidad McGill.
Reagents | |||
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
ATP | SIGMA | a2383-5G | |
D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
software | |||
Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
DynamX | Waters | version 3.0 | |
MassLynx | Waters | version 4.1 | |
Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Instrument and equipment | |||
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
HDX Manager | Waters | ||
microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
Waters Synapt G2-Si | Waters |