Summary

Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов

Published: May 04, 2020
doi:

Summary

Лантипептидные синтезы катализует многоступенчатые реакции во время биосинтеза пептидных натуральных продуктов. Здесь мы описываем непрерывный, снизу вверх, серо-дейтерий обмена масс-спектрометрии (HDX-MS) рабочий процесс, который может быть использован для изучения конформации динамики lanthipeptide синтезетаз, а также других аналогичных ферментов, участвующих в пептид природного продукта биосинтеза.

Abstract

Масс-спектрометрия обмена водородом дейтерия (HDX-MS) является мощным методом биофизической характеристики ферментно-конформативных изменений и ферментно-субстратных взаимодействий. Среди его многочисленных преимуществ, HDX-MS потребляет только небольшое количество материала, может быть выполнена в почти родных условиях без необходимости фермента / субстрата маркировки, и может обеспечить пространственно решенную информацию о ферментной конформации динамики даже для крупных ферментов и мультипротеин комплексов. Метод инициируется путем разбавления фермента интереса в буфер, подготовленный в D2O. Это вызывает обмен протия в пептидных аминах (N-H) с дейтерия (N-D). В желаемых точках обмена, реакция aliquots утоляются, фермент протеолизирован в пептиды, пептиды разделены ультра-производительной жидкой хроматографии (UPLC), и изменение массы каждого пептида (из-за обмена водорода на дейтерий) регистрируется MS. Количество поглощения дейтерия каждым пептидом сильно зависит от местной среды склеивания водорода этого пептида. Пептиды, присутствующие в очень динамичных регионах дейтерия ферментного обмена очень быстро, в то время как пептиды, полученные из хорошо упорядоченных регионов, проходят обмен гораздо медленнее. Таким образом, скорость HDX сообщает о местной конформациальной динамике ферментов. Возмущения к уровням поглощения дейтерия в присутствии различных лигандов могут быть использованы для карты лигандовых связывающих участков, выявления алостерических сетей и понимания роли конформациальной динамики в функции ферментов. Здесь мы проиллюстрировали, как мы использовали HDX-MS, чтобы лучше понять биосинтез типа пептидных натуральных продуктов, называемых лантипептидами. Лантипептиды – это генетически закодированные пептиды, которые пост-переводно модифицируются крупными, многофункциональными, конформно-динамическими ферментами, которые трудно изучать с помощью традиционных подходов структурной биологии. HDX-MS обеспечивает идеальную и адаптируемую платформу для изучения механистических свойств этих типов ферментов.

Introduction

Белки являются структурно динамические молекулы, которые образец различных конформаций на временных масштабах, начиная от фемтосекундного масштаба вибрации связи для перестановки целых белковых доменов, которые могут произойти в течениемногих секунд 1. Эти конформные колебания часто являются критическими аспектами функции фермента/белка. Например, конформациальные изменения, вызванные связыванием лигандов, часто критически важны для модуляции функции ферментов, либо путем организации активных остатков участка, необходимых для катализа, определения сайтов связывания субстрата в последовательных кинетических механизмах, защиты реактивных промежуточных веществ от окружающей среды, либо путем модуляции функции ферментов через алостерические сети. Недавние исследования также показали, что конформативная динамика может быть сохранена на протяжении всей эволюции и что возмущения к сохраненным молекулярным движениям могут быть коррелированы с изменениями в специфичности субстрата и появлением новых функций фермента2,3.

В последние годы масс-спектрометрия обмена водородом-дейтерия (HDX-MS) быстро стала мощным методом для зондированиятого,как конформациальные ландшафты белка реагируют на возмущения, такие как связывание лиганда или мутагенез4,5,6,7. В типичном эксперименте HDX-MS(рисунок 1),протеин интереса помещен в буфер подготовленный в D2O, который вызывает замену растворителя-обменяемых протонов с deuteria. Скорость обмена амиде moiety пептидных связей сильно зависит от рН, местной аминокислотной последовательности, а также от местной структурнойсреды амиде 8. Амидес, которые занимаются водородными взаимодействиями связи (например, присутствующих в α-хеликах и β-листах), обмениваются медленнее, чем амида в неструктурированных регионах белка, которые подвергаются воздействию растворителя. Таким образом, степень поглощения дейтерия является отражением структуры фермента. Ферменты, которые являются конформациально динамическими, или которые проходят структурные переходы на связывание лиганда, как ожидается, даст измеримый ответ HDX.

Механистическая основа медленного обменного курса структурированного амеда показана на рисунке 25,8,9. Для того, чтобы пройти HDX, структурированная область должна сначала временно попробовать развернутую конформацию, так что молекулы растворителя, которые катализингировать обмен HDX через определенный кислотный/базовый химический механизм, имеют доступ к обмениваемому амиду. В конечном счете, относительные величины химического обменного курса(kchem)и скорость складывания и складывания(kopen и kclose)определяют курс HDX, измеренный вэксперименте 5,8. Из этой простой кинетической модели ясно, что степень поглощения дейтерия будет отражать лежащую в основе конформацию динамики (определяемую kopen и kclose). Большинство экспериментов HDX-MS проводятся в рабочем процессе снизу вверх, где, после реакции обмена, белок интереса переваривается в пептиды и поглощение дейтерия каждым пептидом измеряется как увеличениемассы 7. Таким образом, HDX-MS позволяет сопоставить возмущения с ферментной конформациальной динамикой на локальном пространственном масштабе пептидов, что позволяет исследователю оценить, как возмущение изменяет динамику в различных областях фермента, представляющих интерес.

Преимущества подхода HDX-MS для выяснения структурной динамики белка многочисленны. Во-первых, метод может быть выполнен с небольшим количеством родного белка или на белковых комплексах в системах с четвертичных структур10. Это даже не обязательно для фермента препарат, используемый ванализе, чтобы быть высоко очищены 11,12, до тех пор, как снизу вверх HDX-MS рабочий процесс обеспечивает достаточное количество уверенно определены пептиды, которые охватывают белковую последовательность интереса. Кроме того, HDX-MS может предоставить информацию о конформации динамики в почти родных условиях без необходимости для сайта конкретных белковой маркировки, как будет использоваться в одной молекулыфлуоресценции исследований 13, и нет предела размера белка или белковогокомплекса,которые могут быть исследованы (что делает подходы, такие как ядерный магнитный резонанс “NMR” спектроскопиисложной) 7,14. Наконец, время решены HDX-MS методы могут быть использованы для изучения внутренне неупорядоченых белков, которые трудно изучить с рентгеновскойкристаллографии 15,16,17,18. Основным ограничением HDX-MS является то, что данные имеют низкое структурное разрешение. Данные HDX-MS полезны для указания на то, где меняется конформациальная динамика, и для выявления связанных конформных изменений, но они не часто дают большое представление о точном молекулярном механизме, обуговающем наблюдаемое изменение. Недавние достижения в сочетании методов диссоциации захвата электронов с данными белка HDX-MS показали обещание для картирования сайтов обмена на одиночныеаминокислотные остатки 19,но последующие биохимические и структурные исследования все еще часто необходимы, чтобы обеспечить ясность структурных моделей, переадресуемых данными HDX-MS.

Ниже представлен подробный протокол для разработки анализа HDX-MS20. Протоколы подготовки образца, представленные ниже, должны быть в целом применимы к любому белку, который демонстрирует хорошую жалкость в aqueous буферах. Более специализированные методы подготовки образца и HDX-MS рабочие процессы доступны длябелков,чем нужно провести анализ в присутствии моющего средства илифосфолипидов 21,22,23,24. Инструментальные настройки для сбора данных HDX-MS описаны для четырехугольного масс-спектрометра высокого разрешения в сочетании с жидкой хроматографической системой. Данные аналогичной сложности и разрешения могут быть собраны на любой из ряда коммерчески доступных жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) систем. Предоставляются также ключевые аспекты обработки данных с использованием коммерчески доступного пакета программного обеспечения. Мы также представляем руководящие принципы для сбора и анализа данных, которые соответствуют рекомендациям, сделанным более широким сообществом HDX-MS12. Описанный протокол используется для изучения динамических структурных свойств HalM2, лантипептид синтетазы, которая катализа multistep созревания антимикробного пептида натуральныйпродукт 20. Мы иллюстрировать, как HDX-MS может быть использован для выявление сайтов связывания субстрата и алостерических свойств, которые ускользали от предыдущей характеристики. Несколько других протоколов по белку HDX-MS были опубликованы в последниегоды 25,26. Вместе с настоящей работой, эти более предыдущие вклады должны обеспечить читателю некоторую гибкость в экспериментальном конструкции.

Protocol

1. Подготовка дейтетерированных реагентов и растворов ферментного запаса Подготовка реагентов, необходимых для реакции HDX (включая любые буферы, соли, субстраты, лиганды и т.д.), как 100–200x концентрированные фондовые растворы в D2O (99,9% атомовая фракция D). Подготовь не менее 50 мл ?…

Representative Results

Необходимо оценить качество протеолитического пищеварения и воспроизводимость рабочего процесса для каждого набора выборочных инъекций. Таким образом, перед выполнением анализов HDX-MS необходимо создать эффективные условия для протеолиза белка интереса, для разделения пептидов с ис?…

Discussion

Рабочий процесс HDX-MS, представленный в этом протоколе, обеспечивает удивительно надежную платформу для картирования пространственного распределения структурно динамических элементов в белках и для изучения того, как эти динамики меняются в ответ на возмущение (связывание лиганда, фе?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Фондом природы Квебека и технологией, Канадским фондом инноваций и фондами стартапов Университета Макгилла.

Materials

Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)
Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O’Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Play Video

Cite This Article
Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

View Video