Лантипептидные синтезы катализует многоступенчатые реакции во время биосинтеза пептидных натуральных продуктов. Здесь мы описываем непрерывный, снизу вверх, серо-дейтерий обмена масс-спектрометрии (HDX-MS) рабочий процесс, который может быть использован для изучения конформации динамики lanthipeptide синтезетаз, а также других аналогичных ферментов, участвующих в пептид природного продукта биосинтеза.
Масс-спектрометрия обмена водородом дейтерия (HDX-MS) является мощным методом биофизической характеристики ферментно-конформативных изменений и ферментно-субстратных взаимодействий. Среди его многочисленных преимуществ, HDX-MS потребляет только небольшое количество материала, может быть выполнена в почти родных условиях без необходимости фермента / субстрата маркировки, и может обеспечить пространственно решенную информацию о ферментной конформации динамики даже для крупных ферментов и мультипротеин комплексов. Метод инициируется путем разбавления фермента интереса в буфер, подготовленный в D2O. Это вызывает обмен протия в пептидных аминах (N-H) с дейтерия (N-D). В желаемых точках обмена, реакция aliquots утоляются, фермент протеолизирован в пептиды, пептиды разделены ультра-производительной жидкой хроматографии (UPLC), и изменение массы каждого пептида (из-за обмена водорода на дейтерий) регистрируется MS. Количество поглощения дейтерия каждым пептидом сильно зависит от местной среды склеивания водорода этого пептида. Пептиды, присутствующие в очень динамичных регионах дейтерия ферментного обмена очень быстро, в то время как пептиды, полученные из хорошо упорядоченных регионов, проходят обмен гораздо медленнее. Таким образом, скорость HDX сообщает о местной конформациальной динамике ферментов. Возмущения к уровням поглощения дейтерия в присутствии различных лигандов могут быть использованы для карты лигандовых связывающих участков, выявления алостерических сетей и понимания роли конформациальной динамики в функции ферментов. Здесь мы проиллюстрировали, как мы использовали HDX-MS, чтобы лучше понять биосинтез типа пептидных натуральных продуктов, называемых лантипептидами. Лантипептиды – это генетически закодированные пептиды, которые пост-переводно модифицируются крупными, многофункциональными, конформно-динамическими ферментами, которые трудно изучать с помощью традиционных подходов структурной биологии. HDX-MS обеспечивает идеальную и адаптируемую платформу для изучения механистических свойств этих типов ферментов.
Белки являются структурно динамические молекулы, которые образец различных конформаций на временных масштабах, начиная от фемтосекундного масштаба вибрации связи для перестановки целых белковых доменов, которые могут произойти в течениемногих секунд 1. Эти конформные колебания часто являются критическими аспектами функции фермента/белка. Например, конформациальные изменения, вызванные связыванием лигандов, часто критически важны для модуляции функции ферментов, либо путем организации активных остатков участка, необходимых для катализа, определения сайтов связывания субстрата в последовательных кинетических механизмах, защиты реактивных промежуточных веществ от окружающей среды, либо путем модуляции функции ферментов через алостерические сети. Недавние исследования также показали, что конформативная динамика может быть сохранена на протяжении всей эволюции и что возмущения к сохраненным молекулярным движениям могут быть коррелированы с изменениями в специфичности субстрата и появлением новых функций фермента2,3.
В последние годы масс-спектрометрия обмена водородом-дейтерия (HDX-MS) быстро стала мощным методом для зондированиятого,как конформациальные ландшафты белка реагируют на возмущения, такие как связывание лиганда или мутагенез4,5,6,7. В типичном эксперименте HDX-MS(рисунок 1),протеин интереса помещен в буфер подготовленный в D2O, который вызывает замену растворителя-обменяемых протонов с deuteria. Скорость обмена амиде moiety пептидных связей сильно зависит от рН, местной аминокислотной последовательности, а также от местной структурнойсреды амиде 8. Амидес, которые занимаются водородными взаимодействиями связи (например, присутствующих в α-хеликах и β-листах), обмениваются медленнее, чем амида в неструктурированных регионах белка, которые подвергаются воздействию растворителя. Таким образом, степень поглощения дейтерия является отражением структуры фермента. Ферменты, которые являются конформациально динамическими, или которые проходят структурные переходы на связывание лиганда, как ожидается, даст измеримый ответ HDX.
Механистическая основа медленного обменного курса структурированного амеда показана на рисунке 25,8,9. Для того, чтобы пройти HDX, структурированная область должна сначала временно попробовать развернутую конформацию, так что молекулы растворителя, которые катализингировать обмен HDX через определенный кислотный/базовый химический механизм, имеют доступ к обмениваемому амиду. В конечном счете, относительные величины химического обменного курса(kchem)и скорость складывания и складывания(kopen и kclose)определяют курс HDX, измеренный вэксперименте 5,8. Из этой простой кинетической модели ясно, что степень поглощения дейтерия будет отражать лежащую в основе конформацию динамики (определяемую kopen и kclose). Большинство экспериментов HDX-MS проводятся в рабочем процессе снизу вверх, где, после реакции обмена, белок интереса переваривается в пептиды и поглощение дейтерия каждым пептидом измеряется как увеличениемассы 7. Таким образом, HDX-MS позволяет сопоставить возмущения с ферментной конформациальной динамикой на локальном пространственном масштабе пептидов, что позволяет исследователю оценить, как возмущение изменяет динамику в различных областях фермента, представляющих интерес.
Преимущества подхода HDX-MS для выяснения структурной динамики белка многочисленны. Во-первых, метод может быть выполнен с небольшим количеством родного белка или на белковых комплексах в системах с четвертичных структур10. Это даже не обязательно для фермента препарат, используемый ванализе, чтобы быть высоко очищены 11,12, до тех пор, как снизу вверх HDX-MS рабочий процесс обеспечивает достаточное количество уверенно определены пептиды, которые охватывают белковую последовательность интереса. Кроме того, HDX-MS может предоставить информацию о конформации динамики в почти родных условиях без необходимости для сайта конкретных белковой маркировки, как будет использоваться в одной молекулыфлуоресценции исследований 13, и нет предела размера белка или белковогокомплекса,которые могут быть исследованы (что делает подходы, такие как ядерный магнитный резонанс “NMR” спектроскопиисложной) 7,14. Наконец, время решены HDX-MS методы могут быть использованы для изучения внутренне неупорядоченых белков, которые трудно изучить с рентгеновскойкристаллографии 15,16,17,18. Основным ограничением HDX-MS является то, что данные имеют низкое структурное разрешение. Данные HDX-MS полезны для указания на то, где меняется конформациальная динамика, и для выявления связанных конформных изменений, но они не часто дают большое представление о точном молекулярном механизме, обуговающем наблюдаемое изменение. Недавние достижения в сочетании методов диссоциации захвата электронов с данными белка HDX-MS показали обещание для картирования сайтов обмена на одиночныеаминокислотные остатки 19,но последующие биохимические и структурные исследования все еще часто необходимы, чтобы обеспечить ясность структурных моделей, переадресуемых данными HDX-MS.
Ниже представлен подробный протокол для разработки анализа HDX-MS20. Протоколы подготовки образца, представленные ниже, должны быть в целом применимы к любому белку, который демонстрирует хорошую жалкость в aqueous буферах. Более специализированные методы подготовки образца и HDX-MS рабочие процессы доступны длябелков,чем нужно провести анализ в присутствии моющего средства илифосфолипидов 21,22,23,24. Инструментальные настройки для сбора данных HDX-MS описаны для четырехугольного масс-спектрометра высокого разрешения в сочетании с жидкой хроматографической системой. Данные аналогичной сложности и разрешения могут быть собраны на любой из ряда коммерчески доступных жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) систем. Предоставляются также ключевые аспекты обработки данных с использованием коммерчески доступного пакета программного обеспечения. Мы также представляем руководящие принципы для сбора и анализа данных, которые соответствуют рекомендациям, сделанным более широким сообществом HDX-MS12. Описанный протокол используется для изучения динамических структурных свойств HalM2, лантипептид синтетазы, которая катализа multistep созревания антимикробного пептида натуральныйпродукт 20. Мы иллюстрировать, как HDX-MS может быть использован для выявление сайтов связывания субстрата и алостерических свойств, которые ускользали от предыдущей характеристики. Несколько других протоколов по белку HDX-MS были опубликованы в последниегоды 25,26. Вместе с настоящей работой, эти более предыдущие вклады должны обеспечить читателю некоторую гибкость в экспериментальном конструкции.
Рабочий процесс HDX-MS, представленный в этом протоколе, обеспечивает удивительно надежную платформу для картирования пространственного распределения структурно динамических элементов в белках и для изучения того, как эти динамики меняются в ответ на возмущение (связывание лиганда, фе?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Фондом природы Квебека и технологией, Канадским фондом инноваций и фондами стартапов Университета Макгилла.
Reagents | |||
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
ATP | SIGMA | a2383-5G | |
D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
software | |||
Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
DynamX | Waters | version 3.0 | |
MassLynx | Waters | version 4.1 | |
Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Instrument and equipment | |||
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
HDX Manager | Waters | ||
microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
Waters Synapt G2-Si | Waters |