Lanthipeptide synthetases يحفز ردود الفعل متعددة الخطوات خلال التمثيل الحيوي للمنتجات الطبيعية الببتيد. هنا، ونحن نصف مستمر، من أسفل إلى أعلى، الهيدروجين الديوتريوم تبادل الطيف الكتل (HDX-MS) سير العمل التي يمكن استخدامها لدراسة الديناميات التركيبية من synthetases lanthipeptide، فضلا عن الإنزيمات المماثلة الأخرى المشاركة في التمثيل الحيوي للمنتج الطبيعي الببتيد.
قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) هو طريقة قوية لتوصيف البيوفيزيائي للتغيرات في تشكيل الإنزيم والتفاعلات بين الإنزيم والركيزة. من بين فوائده العديدة ، يستهلك HDX-MS كميات صغيرة فقط من المواد ، ويمكن إجراؤه في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع علامات الإنزيم / الركيزة ، ويمكن أن يوفر معلومات محلولة مكانيا عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم – حتى بالنسبة للإنزيمات الكبيرة ومجمعات متعددة البروتين. يتم البدء في هذه الطريقة عن طريق تخفيف إنزيم الفائدة في المخزن المؤقت المعد في D2O. وهذا يؤدي إلى تبادل البروتيوم في السندات الببتيد amides (N-H) مع الديوتريوم (N-D). في نقاط وقت التبادل المطلوبة ، يتم إخماد تفاعل aliquots ، ويتم إعادة دمج الإنزيم في الببتيدات ، ويتم فصل الببتيدات عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) ، ويتم تسجيل التغير في كتلة كل ببتيد (بسبب تبادل الهيدروجين للديوتريوم) من قبل MS. تعتمد كمية امتصاص الديوتريوم من قبل كل ببتيد بشكل كبير على بيئة الترابط الهيدروجيني المحلية لذلك الببتيد. الببتيدات الموجودة في مناطق ديناميكية جدا من الديوتريوم تبادل الانزيم بسرعة كبيرة، في حين الببتيدات المستمدة من المناطق مرتبة جيدا تخضع لتبادل ببطء أكثر من ذلك بكثير. وبهذه الطريقة، يبلغ معدل HDX عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم المحلية. يمكن بعد ذلك استخدام الاضطرابات إلى مستويات امتصاص الديوتريوم في وجود ليغاندس مختلفة لرسم خريطة لمواقع الربط ليغاند، وتحديد شبكات allosteric، وفهم دور ديناميات تشكيلية في وظيفة الانزيم. هنا، نوضح كيف استخدمنا HDX-MS لفهم التمثيل الحيوي لنوع من المنتجات الطبيعية الببتيد يسمى lanthipeptides بشكل أفضل. اللانثيبتيدات هي الببتيدات المشفرة وراثيا التي يتم تعديلها بعد الترجمة من قبل إنزيمات كبيرة متعددة الوظائف وديناميكية تشكيلية يصعب دراستها مع نهج البيولوجيا الهيكلية التقليدية. يوفر HDX-MS منصة مثالية وقابلة للتكيف للتحقيق في الخصائص الميكانيكية لهذه الأنواع من الإنزيمات.
البروتينات هي جزيئات ديناميكية هيكليا التي عينة تشكيلات مختلفة على نطاقات زمنية تتراوح بين اهتزاز السندات على نطاق femtosecond لإعادة ترتيب مجالات البروتين بأكملها التي يمكن أن تحدث على مدى ثوان عديدة1. هذه التقلبات تشكيلية غالبا ما تكون الجوانب الحاسمة للانزيم / وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون التغييرات التشكيلية الناجمة عن الربط الرابط ذات أهمية حاسمة لتعديل وظيفة الإنزيم ، إما عن طريق تنظيم بقايا الموقع النشطة اللازمة للحفز ، أو تحديد مواقع ربط الركيزة في آليات حركية متسلسلة ، أو حماية الوسيطات التفاعلية من البيئة ، أو عن طريق تعديل وظيفة الإنزيم عبر شبكات allosteric. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن ديناميات تشكيلية يمكن الحفاظ عليها في جميع أنحاء التطور، وأنه يمكن ربط الاضطرابات إلى الحركات الجزيئية المحفوظة مع التغيرات في خصوصية الركيزة وظهور وظائف إنزيم جديدة2،3.
في السنوات الأخيرة ، ظهر قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) بسرعة كتقنية قوية للتحقيق في كيفية استجابة المناظر الطبيعية المطابقة للبروتين للاضطرابات مثل الربط ليغاند أو موتاجينيسيس4،5،6،7. في تجربة HDX-MS النموذجية (الشكل 1)، يتم وضع بروتين مثير للاهتمام في المخزن المؤقت المعد في D2O ، مما يؤدي إلى استبدال البروتونات القابلة للتبادل مع الديوتيريا. سعر الصرف من moiety أميدي من السندات الببتيد يعتمد بقوة على درجة الحموضة، وتسلسل الأحماض الأمينية المحلية، وعلى البيئة الهيكلية المحلية من أميدي8. Amides التي تشارك في التفاعلات الترابط الهيدروجين (مثل تلك الموجودة في α helices وأوراق β) تبادل أبطأ من وسط في المناطق غير المنظمة من البروتين التي تتعرض للمذيبات السائبة. وبالتالي ، فإن مدى امتصاص الديوتريوم هو انعكاس لهيكل الإنزيم. ومن المتوقع أن الإنزيمات التي هي ديناميكية تشكيليا، أو التي تخضع لتحولات هيكلية على الربط ليغاند، أن تسفر عن استجابة HDX قابلة للقياس.
يظهر الأساس الميكانيكي لسعر الصرف البطيء للamide منظم في الشكل 2 5،8،9. من أجل الخضوع ل HDX ، يجب على المنطقة المنظمة أولا أن تقوم أولا بأخذ عينات عابرة من تشكيل تم الكشف عنه ، بحيث يمكن للجزيئات المذيبة التي تحفز تبادل HDX عبر آلية كيميائية حمضية / أساسية محددة ، الوصول إلى أميد القابلة للتبادل. في نهاية المطاف ، فإن المقادير النسبية لسعر الصرف الكيميائي(ككيم)ومعدلات الطي وإعادة طي (كمفتوحة وك إغلاق) تحديد معدل HDX تقاس في التجربة5،8. من هذا النموذج الحركي البسيط ، من الواضح أن مدى امتصاص الديوتريوم سيعكس الديناميكيات التوافقية الأساسية (كما يحددها kopen و kclose). يتم تنفيذ معظم التجارب HDX-MS في سير العمل من أسفل إلى أعلى حيث، بعد رد فعل تبادل، يتم هضم البروتين من الفائدة في الببتيدات ويتم قياس امتصاص الديوتريوم من قبل كل الببتيد كزيادة في كتلة7. وبهذه الطريقة ، يسمح HDX-MS بالاضطرابات لديناميكيات تشكيل الإنزيم ليتم تعيينها على النطاق المكاني المحلي للببتيدات ، مما يسمح للباحث بتقييم كيفية تغيير الاضطراب للديناميكيات في مناطق مختلفة من إنزيم الاهتمام.
مزايا نهج HDX-MS لتوضيح الديناميات الهيكلية البروتين عديدة. أولا ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بكميات صغيرة من البروتين الأصلي أو على مجمعات البروتين في أنظمة ذات بنية رباعية10. ليس من الضروري حتى لإعداد الانزيم المستخدمة في المقايسة أن يكون تنقية عالية11،12، طالما أن من أسفل إلى أعلى HDX – MS سير العمل يوفر عددا كافيا من الببتيدات التي تم تحديدها بثقة التي تغطي تسلسل البروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، HDX-MS يمكن أن توفر معلومات عن ديناميات تشكيلية في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع العلامات البروتين موقع محدد كما يمكن استخدامها في دراسات مضان جزيء واحد13،وليس هناك حد لحجم البروتين أو البروتين المعقدة التي يمكن التحقيق فيها (مما يجعل النهج مثل الرنين المغناطيسي النووي [NMR] الطيف تحديا)7،14. وأخيرا، يمكن استخدام طرق HDX-MS التي تم حلها زمنيا لدراسة البروتينات المضطربة في جوهرها، والتي يصعب دراستها مع التصوير البلوري بالأشعة السينية15و16و17و18. القيد الرئيسي ل HDX-MS هو أن البيانات ذات دقة هيكلية منخفضة. إن بيانات HDX-MS مفيدة للإشارة إلى الأماكن التي تتغير فيها الديناميكيات التوافقية وللكشف عن التغيرات التوافقية المقترنة ، ولكنها لا توفر في كثير من الأحيان الكثير من البصيرة في الآلية الجزيئية الدقيقة التي تقود التغيير الملحوظ. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في الجمع بين أساليب التفكك التقاط الإلكترون مع البروتين HDX-MS البيانات واعدة لرسم خرائط مواقع تبادل لبقايا الأحماض الأمينية واحد19،ولكن لا تزال هناك حاجة في كثير من الأحيان متابعة الدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية لتوفير الوضوح للنماذج الهيكلية التي أحالها HDX-MS البيانات.
أدناه، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتطوير فحص HDX-MS20. يجب أن تنطبق بروتوكولات إعداد العينة المعروضة أدناه بشكل عام على أي بروتين يظهر قابلية جيدة للذوبان في المخازن المؤقتة المائية. تتوفر طرق إعداد عينات أكثر تخصصا وسير عمل HDX-MS للبروتينات من الحاجة إلى الفحص في وجود المنظفات أو الفوسفوليبيدات21و22و23و24. يتم وصف الإعدادات الفعالة لجمع بيانات HDX-MS لمطياف كتلة رباعي القطب عالي الدقة مقرون بنظام الكروماتوغرافيا السائلة. ويمكن جمع بيانات مماثلة التعقيد والدقة على أي واحد من عدد من نظم قياس الطيف الكروماتوغرافيا الكتلية السائلة المتاحة تجاريا. كما يتم توفير الجوانب الرئيسية لمعالجة البيانات باستخدام حزمة برامج متاحة تجاريا. كما نقدم إرشادات لجمع البيانات وتحليلها تتسق مع التوصيات التي قدمها مجتمع HDX-MSالأوسع 12. يستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة الخصائص الهيكلية الديناميكية ل HalM2 ، وهو موالفة lanthipeptide التي تحفز نضوج متعدد الخطوات لمنتج الببتيد الطبيعي المضاد للميكروبات20. نحن نوضح كيف يمكن استخدام HDX-MS للكشف عن مواقع الربط الركيزة والخصائص التستوستيرون التي استعصت على التوصيف السابق. وقد نشرت العديد من البروتوكولات الأخرى على البروتين HDX-MS في السنوات الأخيرة25,26. وإلى جانب العمل الحالي، ينبغي أن توفر هذه المساهمات السابقة للقارئ بعض المرونة في التصميم التجريبي.
يوفر سير عمل HDX-MS المعروض في هذا البروتوكول منصة قوية بشكل ملحوظ لرسم خرائط التوزيع المكاني للعناصر الديناميكية هيكليا في البروتينات والتحقيق في كيفية تغير هذه الديناميكيات استجابة للاضطرابات (الربط الرابط ، وتولد الانزيم ، وما إلى ذلك). يحمل HDX-MS العديد من المزايا المتميزة على نهج البيول?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا، ومؤسسة كيبيك للطبيعة والتكنولوجيات، والمؤسسة الكندية للابتكار، وصناديق بدء جامعة ماكغيل.
Reagents | |||
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
ATP | SIGMA | a2383-5G | |
D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
software | |||
Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
DynamX | Waters | version 3.0 | |
MassLynx | Waters | version 4.1 | |
Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Instrument and equipment | |||
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
HDX Manager | Waters | ||
microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
Waters Synapt G2-Si | Waters |